烟草引种资源黑胫病、TMV及PVY抗性分子标记辅助筛选

本研究对54份国外引进烟草种质资源进行了黑胫病、烟草普通花叶病(TMV)及马铃薯Y病毒病(PVY)等主要病害抗性的分子标记辅助筛选,并对上述资源同步开展了TMV及黑胫病人工接种抗病分析。研究结果表明:共筛选到2份资源抗黑胫病、TMV及PVY,5份资源双抗黑胫病及PVY和1份资源双抗TMV及PVY。黑胫病与TMV抗性分子标记鉴定的结果为人工接种抗性鉴定结果证实,即筛选到11份资源含抗TMV的N基因和14份资源含抗黑胫病的Ph基因。本研究结果有助于大批量的开展种质资源的抗性筛选,加快抗病烟草品种选育进程。     

柑桔线虫抗性主基因座Tyr1的特异标记开发与遗传作图改进(英文)

本文利用先期从BAC文库获得的NBS-LRR类候选抗病基因克隆序列Pt8a和Pt9a,进一步开发与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1连锁的分子标记。以Pt8a和Pt9a序列作探针,通过高密度克隆印迹杂交,从BAC文库筛选出200个以上的阳性克隆,以阳性克隆插入序列设计引物,对柑桔抗线虫材料和感线虫材料开展以PCR扩增为基础的集群分离分析,发现一部分克隆序列与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1紧密连锁;再通过染色体步行测序,分别从3个克隆（7A4,4L17和29F20）获得3个完整的NBS-LRR类候选抗病基因序列。从此类序列开发更高特异性的分子标记,并在利用原有分子标记的基础上,对柑桔线虫抗性杂交后代群体（9145 family）构建较高密度的遗传图谱;同时,将新开发的分子标记应用于柑桔衰退病抗性杂交后代群体（9401 family）,以初步估算柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr]与柑桔衰退病抗性基因Ctv的遗传距离。     

抗主要病害烟草种质资源的筛选

为了筛选出抗主要病害的烟草种质资源推荐给育种者应用于选育抗病新品种,从云南烟草种质库中分别选择了56个、26个和146个烟草种质资源,采用人工接种的方法开展黑胫病、南方根结线虫病和TMV的抗性鉴定.结果表明,共有17个种质抗黑胫病,如筑波1号、津引1号、落地黄、Coker Tobacco、安选79-1、OX414、H80A432和革新3号等;有11个中抗黑胫病,如巴引1号、Carifoniavalle、8022、MC 101、Islangold、金星6007;13个中感黑胫病,15个感黑胫病.NC95、台烟7号、Carifoniavalle、筑波1号、巴引1号、巴引2号、小白筋和MC101等8个品种抗南方根结线虫病,16个品种中抗南方根结线虫病.抗、中抗、中感和感TMV的品种分别为38、45、52和11个,所占的百分比分别为26.03%、30.82%、35.62%和7.53%.所有筛选出的抗病品种都推荐给育种家选择用于选育新品种.     

人工接种诱发烟草黑胫病抗性鉴定的应用研究

为提高烟草黑胫病抗性鉴定结果的稳定性,笔者于2001—2006年采用人工接种诱发抗性方法不连续地对15个烤烟新品系（6614、8504、9601、9717、8902-42、CF209、CF964、CF986、RGH12、YH01、YH02、YH05、YNH09、云烟97和云烟98）进行了烟草黑胫病抗性鉴定研究,本鉴定方法提出了烟草黑胫病培养和保存技术及接种体的制备方法,提出了烟草黑胫病大田期的接种时间及接种量。从鉴定结果看,15个品系不同年份的平均病指均在25以下,SSR分析发现,与抗病对照K326和革新三号的抗性无显著差异,均达抗病水平,且各品系不同年份间抗性稳定,说明该研究所用烟草黑胫病抗性鉴定方法稳定可靠。     

柑桔线虫抗性主基因座Tyrl的特异标记开发与遗传作图改进

本文利用先期从BAC文库获得的NBS-LRR类候选抗病基因克隆序列Pt8a和Pt9a,进一步开发与柑桔线虫抗性丰效基因位点Tyrl连锁的分子标记.以Pt8a和Pt9a序列作探针,通过高密度克隆印迹杂交,从BAC文库筛选出200个以上的阳性克隆,以阳性克隆插入序列设计引物,对柑桔抗线虫材料和感线虫材料开展以PCR扩增为基础的集群分离分析,发现一部分克隆序列与柑桔线虫抗性主效基因位点Txrl紧密连锁;再通过染色体步行测序,分别从3个克隆(7A4,4L17和29F20)获得3个完整的NBS-LRR类候选抗病基因序列.从此类序列开发更高特异性的分子标记,并在利用原有分子标记的基础上,对柑桔线虫抗性杂交后代群体(9145 family)构建较高密度的遗传图谱:同时,将新开发的分子标记应用于柑桔衰退病抗性杂交后代群体(9401 family),以初步估算柑桔线虫抗性主效基因位点Tyrl与柑桔衰退病抗性基因Ctv的遗传距离.     

烟草种质资源黑胫病抗性鉴定及亲缘关系SSR分析

黑胫病是烟草大田生产的主要病害之一。烟草种质资源抗病性的筛选、鉴定和亲缘关系分析是抗病育种的基础。利用黑胫病1号生理小种对49份种质资源进行了抗病性鉴定,并利用SSR分子标记进行了遗传多样性和亲缘关系分析。结果表明:24份材料表现为抗黑胫病,其中大叶永烟、G80、E9、MS212-8的抗性比较好;7份材料表现为中抗黑胫病;中感黑胫病和高感黑胫病材料共6份;12份材料表现为感黑胫病。49份烟草种质资源的平均有效等位基因数为3.06(1.31),平均Shannon’s信息指数为1.18(0.36)。23对SSR引物在遗传相似系数为0.66时将49份材料分为4个类群,第Ⅰ类群为抗病材料K326;第Ⅱ类群包括6份材料;第Ⅲ类群为4份感病材料;第Ⅳ类群包括38份材料。抗病材料主要集中在第Ⅳ类群,其遗传背景狭窄。     

抗黑胫病地方烟草品种遗传多样性分析与评价

为了拓宽黑胫病抗性育种亲本材料的遗传背景以及充分发掘和利用地方品种的抗病基因资源,本研究利用筛选获得的25对SSR引物对35份抗黑胫病地方烟草品种进行了亲缘关系聚类分析和遗传多样性分析。结果表明:(1) 25对SSR引物共检测到85个多态性位点,聚类分析结果表明35份地方烟草品种的遗传相似性系数分布范围为0.57~0.87;(2)在遗传相似性系数为0.57时,可以将35份抗黑胫病地方烟草品种分成两个类群,A类包括20份烤烟品种,B类包括15份晒烟品种。在遗传相似系数0.62烤烟分为2个类群,晒烟分为3分类群;(3)在抗黑胫病地方烟草品种中观测等位基因数的平均值为3.32个;有效等位基因数的平均值为2.651;观测杂合度的平均值为0.395;期望杂合度的平均值为0.596。平均Nei’s基因多样性指数(H)为0.558,平均Shannon’s指数(I)为1.020。不同地方的抗黑胫病烟草品种间具有一定的遗传差异,品种之间具有较高的遗传多样性,且品种间的亲缘关系和品种的地理来源之间具有一定的相关性。     

玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性基因的挖掘

玉米穗腐病是一种严重危害玉米生产的真菌性病害,而目前在世界范围内玉米育种上应用的大多数自交系缺少对穗腐病的抗性。玉米穗腐病抗性位点的挖掘和抗病基因的克隆,对玉米穗腐病的遗传改良至关重要。本研究旨在通过转录组测序和全基因组关联分析的方法进行玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病抗性位点的挖掘并初步确定候选基因。抗病自交系法A和感病自交系掖81162的转录组测序结果表明,人工接种拟轮枝镰孢菌后7d两个自交系的差异表达基因有10,761个。通过全基因组关联分析共检测到5个与穗腐病抗性显著相关的SNP,这些SNP分布在1号和9号染色体上。通过比对B73 RefGen_v3并注释,发现SNP位点附近涉及的基因包括酰基激活酶1过氧化物酶体、蛋白磷酸酶2C 48、镁转运蛋白、受体蛋白激酶CRINKLY4和锌指CCCH域蛋白19。将在转录组测序中获得差异表达基因和全基因组选择中关联到的基因进行比对,发现全基因组关联分析中关联到的锌指CCCH域蛋白19同时也是转录组测序中获得的差异表达基因,表明锌指CCCH域蛋白19可能与玉米拟轮枝镰孢菌穗腐病的抗性相关。本研究结果不仅能为抗病基因的克隆和玉米的抗病分子育种提供一定的理论依据和重要的遗传资源,而且能为玉米和病原菌的相互作用机理的解析奠定基础。     

中国油菜对黑胫病的抗性评价及抗病基因推导研究

为掌握中国油菜品种的黑胫病抗性水平,为抗病育种及品种合理布局提供理论依据。在室内采用子叶穿刺接种法,对35个油菜品种开展了黑胫病的抗性评价及抗病基因推导研究。供试品种中没有发现对病原菌Leptosphaeria maculans和Leptosphaeria biglobosa表现高抗或免疫的品种,只有3个品种可以兼抗Leptosphaeria maculans和Leptosphaeria biglobosa,但均表现低抗。供试的35个品种对12个菌株共产生了17种反应型,其中12个品种的反应型与鉴别寄主的完全相同,18个品种的反应型与鉴别寄主的非常相近,5个品种的反应型不同于任何鉴别寄主。抗病基因推导,已知的12个黑胫病抗性基因Rlm1~9,Lep R1~3多数以基因组合的形式分布在我国的30个品种中,这些主栽品种可能含有已知的或新的抗病基因。说明现有的油菜种质资源中可能蕴藏着对改良黑胫病抗性具有潜在应用价值的基因资源。     

农杆菌介导脂滴包被蛋白基因8-3转化烟草的研究

为开发新的抗菌核病基因,针对抗病相关的脂滴包被蛋白基因8-3,设计了分别带有酶切位点Xba I和BamH I的一对引物,从克隆载体pMD19-T-8-3中扩增到基因8-3,双酶切8-3并连接到植物表达载体pBI 121上;将重组质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404中,通过其介导将8-3基因转化到烟草中;获得了35株抗性转化株,PCR及测序分析鉴定阳性植株为21株,RT-PCR检测到基因8-3在其中能够表达;通过接种核盘菌和草酸处理试验,表明8-3基因可使烟草提高了草酸耐受水平,从而对菌核病具备一定的抗性。本实验研究了潜在功能基因8-3的抗病性,为植物抗菌核病的研究奠定了基础。     

烟草黑胫病的生物防治研究进展

烟草黑胫病是一种由烟草疫霉菌引起的烟草上重要的毁灭性病害,严重威胁了烟草行业的可持续发展。近年来,烟草黑胫病在生物防治方面取得了较大的研究进展。为了给今后烟草黑胫病生物防治研究提供参考依据,笔者综述了生防微生物(细菌、真菌、放线菌)和植物源杀菌剂防治烟草疫霉菌的研究进展,介绍了其生防机理。此外,笔者还分析了全球变暖背景下生物防治烟草黑胫病面临的新问题,并对未来的研究工作进行了展望。     

烟草黑胫病生防菌筛选及防效初探

对采自云南省9个地州29个县的141个采集土样的微生物分离、筛选出280个对黑胫病菌有拮抗作用的菌株。拮抗平板复筛获得抑菌半径大于17mm的拮抗菌19株。温室盆栽表明,各参试菌株在盆栽试验中对黑胫病均表现一定的防效,其中以HJ01912表现最好,防效达73.80％,与化学药剂对照防效相当。     

烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗性测定

为合理防治烟草黑胫病,减少抗药性产生,从云南省6个地州分离烟草黑胫病菌菌株34个,就分离菌株对甲霜灵的抗药性进行了测定,结果表明,供试34个菌株中中高抗菌株12个,中抗菌株比例较高5个,低抗菌株17个。不同来源的烟草黑胫病原菌株的抗药性存在差异,以文山、玉溪的菌株抗药性最高,昭通、曲靖菌株抗药性最低,抗性倍数最高达16倍,其余地州抗药性居中。不同地州分离菌株高、中、低抗菌株的比例存在明显差别。分离自楚雄双柏县雨龙乡的113#菌株抗药性最强,来自大理巍山县大仓镇的218#菌株抗药性最低。34株烟草黑胫病菌菌株对甲霜灵的EC50值平均为0.0148μg/ml,范围在0~0.053μg/ml。     

烟草黑胫病拮抗细菌复合菌株的筛选与防治效果评价

从烟草根际土壤中筛选对烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)具有拮抗作用的细菌,并对拮抗菌株进行复配筛选,以期为烟草黑胫病的生物防治提供高效生防资源。从贵州省毕节市、四川省泸州市种植烟草的田地采集根际土壤样品,平板稀释法分离土壤细菌,平板对峙试验筛选对烟草黑胫病菌有拮抗作用的菌株,相容性试验测定亲和性较好的菌株组合,对获得的菌株和复配菌株进行进一步盆栽和大田试验,测定其对黑胫病的防治效果,并对拮抗效果较好的菌株进行16S rDNA鉴定。在采集到的17份土壤样品中共分离到247株细菌,初筛获得19株对烟草黑胫病菌有拮抗作用的菌株,相容性测定筛选出6株亲和性较好的拮抗细菌B3和B64、B41和B57以及L7和L47。进一步的抑菌、盆栽和大田试验表明以复配菌株B41B57和L7L47抑菌效果最佳,盆栽试验防治效果分别达到75.72%和77.95%,大田试验中防治效果分别达67.99%和71.40%,且复配菌株抑菌效果高于单一菌株。16S rDNA序列分析鉴定拮抗细菌B41为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),L7、L47为解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens),B57为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。复配菌株B41B57和L7L47对烟草黑胫病具有良好的防治效果,可作为烟草黑胫病生物防治的有效生防资源。     

不同培养基对烟草黑胫病菌生长的影响

烟草黑胫病是烟草生产上一类毁灭性真菌病害,严重影响烟草的生产。为了烟草黑胫病的深入研究顺利进行,就云南烟草黑胫病菌在不同培养基上的生长情况进行了分析,结果表明烟草黑胫病菌株菌株在燕麦培养基、选择性培养基和玉米培养基上生长最好,菌落生长快,产生孢子囊的数量多、生物量高,不同菌株对培养基有一定程度上的选择性。     

芥菜提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌活性及抑菌谱测定

研究芥菜提取物的抑菌活性,为开发芥菜作为杀菌剂应用于农业生产奠定基础,为芥菜资源的合理利用提供理论依据。采用菌丝生长速率法,测定芥菜提取物对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、葡萄座腔菌和烟草黑胫菌等植物病原菌菌丝生长的抑制作用。结果表明：采用不同有机溶剂获得的芥菜提取物对西瓜枯萎病均有一定抑制作用,以95%乙醇提取的抑菌效果最好,其提取物的抑菌率可达90%以上。最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为0.5、1.0 g/mL,通过毒力方程的测定,它的半抑菌浓度(EC₅₀)为0.2212 g/mL。通过试验对其他10种植物病原菌的抑菌活性表明：芥菜乙醇提取物对水稻纹枯菌、葡萄座腔菌、烟草黑胫菌、辣椒菌核病菌等4种病原菌的抑菌效果较强,其EC₅₀分别为0.0898、0.1265、0.1679、0.1685 g/mL,对葡萄炭疽病菌的抑制效果最弱,EC₅₀为0.5833 g/mL。芥菜提取物具有很强的抑菌活性,并且具有较广的杀菌谱,值得进一步深入研究。     

不同消毒剂对烟草黑胫病菌的抑制作用

漂浮育苗是一项较先进的育苗技术,对育苗盘、池膜、剪叶器具和操作的严格消毒是培育无病壮苗的关键环节。为烟叶生产上更合理地选用消毒剂,以甲霜灵为对照药剂,分析了几种常用消毒剂对烟草黑胫病菌菌丝生长和孢子囊产生的抑制作用,结果表明大多数漂浮育苗消毒药剂适宜浓度对烟草黑胫病菌都有一定的抑制作用,包括硫酸铜、美国消毒剂、0.6%菌毒净、7%有效氯次氯酸钠、24%毒消、40%育宝、10%二氧化氯和磷酸三钠,消毒药剂高锰酸钾与30%有效氯漂白粉对烟草黑胫病菌菌丝和孢子囊均无抑制作用。     

荆芥茎枯病拮抗木霉菌筛选及其田间防效评价

通过室内对峙培养方法,从16株候选木霉菌中筛选出对荆芥茎枯病菌有较强抑制活性的绿色木霉M3和Tv04-2菌株,抑菌率分别高达83.2%和78.2%;田间试验发现,M3菌株对荆芥茎枯病害的田间防效明显高于Tv04-2菌株.结果表明,本研究筛选出的绿色木霉M3菌株具有理想的生防潜力,可作为防控荆芥茎枯病害的候选生防菌.     

一种土壤中烟草疫霉菌的快速分离鉴定及计数方法

烟草疫霉菌是一种常见的土传植物病原菌,其所导致的烟草黑胫病对烟草业造成了巨大经济损失。准确统计土壤中烟草疫霉菌的数量,有助于了解土壤中烟草疫霉菌的分布,密度以及发生动态,进而可以及时发布灾情预报,减少经济损失。本研究采用土壤稀释平板法,在选择性培养基上较好的对烟草疫霉菌进行了分离;运用微量真菌DNA提取方法成功提取了平板上菌株的DNA;采用特异引物,对提取的7个疑似菌株DNA进行PCR验证,结果有6个菌株扩增出了737bp的烟草疫霉菌特异性目的基因片段;ITS进一步验证6个菌株与已报道烟草疫霉菌相似度达99%以上;表明6个疑似菌株是烟草疫霉菌。该方法具有相对准确、低成本、简单易推广的优点。     

土壤拮抗链霉菌R15菌株发酵产物的抑菌作用

对一株土壤拮抗链霉菌（Streptomyce spp.）R15菌株发酵液的抑菌效果、热稳定性和酸碱稳定性以及作用机制进行了初步研究。结果表明，拮抗链霉菌R15发酵液对棉花枯萎病菌分生孢子萌发抑制作用强，抑制率达98.37%。烟草赤星病菌孢子萌发后芽管顶端膨大成球形，芽管停止生长；烟草炭疽病菌孢子萌发后不能产生附着胞，且芽管顶端有突起。处理烟草黑胫病菌和辣椒疫霉病菌菌丝畸变、扭曲、菌丝壁消解；R15通过菌丝缠绕、穿透、紧贴的方式重寄生于烟草黑胫病菌菌丝上，致使菌丝断裂。链霉菌R15发酵液的热稳定性和酸碱稳定性较强，在20~55℃，pH3~9范围内都具有抑菌活性。