多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价

采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进行了免疫保护效果和血清效价的研究.结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6％和77.0％;用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97;用多效价载体疫苗浸泡免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2％和11.7％.血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64.上述结果表明,所构建的疫苗MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子.本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑.     

嗜水气单胞菌灭活苗对林蛙免疫效果的初步研究

用分离于患红腿病的长白山中国林蛙的嗜水气单胞菌,采用热灭活的方法制成嗜水气单胞菌灭活苗,通过不同的途径免疫接种林蛙,通过测定受免林蛙血清中凝集抗体效价,探讨林蛙对热灭活的嗜水气单胞菌菌苗的免疫应答状况.结果表明,受免林蛙血清中凝集抗体效价可达到27,明显高于对照组.通过检测免疫林蛙的免疫保护率发现受免林蛙中口服免疫组、浸泡免疫组、腹腔注射组、肌肉注射组的免疫保护力可达71%、76%、59%、47%.     

山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果

为研究山莨菪碱作为佐剂在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的作用,将山莨菪碱和嗜水气单胞菌全菌灭活疫苗联合浸泡免疫异育银鲫,首次浸泡免疫7d后加强免疫1次.通过实时荧光定量PCR检测第2、4、7、11、14和21天脾脏中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶的mRNA表达量,并在第21天进行同源菌株活菌攻击实验.结果显示,山莨菪碱组第4天IgM和IL-1 β的表达量达到最高值,分别为28.3和332.7;而无佐剂疫苗组第11天IgM和IL-1β达到最高值,分别为56.1和791.8.山莨菪碱组的补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的表达量都显著高于无佐剂组和对照组,且表达持续时间长.活菌攻击实验表明山莨菪碱组的相对免疫保护率可达80.0％,显著高于无佐剂组的56.0％.结果表明,山莨菪碱与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫银鲫,可以增强脾脏中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高银鲫相对免疫保护率.     

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫效果评价

为了筛选细菌的疫苗候选蛋白,本实验根据课题组前期的研究,挑选了2个嗜水气单胞菌外膜蛋白(A0KLQ6和A0KH89),以A0KHR9(OmpAII)为对照,通过比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白通过腹腔注射与浸泡免疫模式,比较和评价斑马鱼的免疫反应与免疫保护效果。结果显示,腹腔注射组和浸泡组与普通蛋白组对比,碳纳米管载蛋白能够显著提高斑马鱼免疫相关基因表达量。腹腔注射组在5μg剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得61.60%、 65.39%和84.96%相对免疫保护率(relative immune protection rate,RPS),在5μg剂量下免疫碳纳米管载蛋白SWCNTs-A0KHR9、SWCNTsA0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得68.10%、77.50%和90.43%的RPSs。浸泡组在40 mg/L剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得30.80%、25.85%和37.80%的RPSs,在40 mg/L最高剂量下免疫碳纳米管载蛋白疫苗SWCNTs-A0KHR9、SWCNTsA0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得63.60%、73.74%和68.49%的RPSs。研究表明,铁离子限制下嗜水气单胞菌外膜蛋白A0KLQ6和A0KH89等能够作为抗嗜水气单胞菌的亚单位疫苗候选蛋白,而单壁碳纳米管载蛋白通过注射免疫与浸泡免疫均能显著提升免疫疗效,是一种疫苗的适宜纳米载体。以上研究为寻找高效的嗜水气单胞菌亚单位疫苗候选蛋白及佐剂提供了理论依据。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后的免疫应答反应与保护效果

为了研究嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt,1869)后的免疫应答反应与保护效果,本研究采用福尔马林灭活法制备嗜水气单胞菌灭活疫苗。通过腹腔注射途径免疫健康施氏鲟,对施氏鲟外周血的红细胞和白细胞数量、白细胞组成、吞噬活性、吞噬指数、血清酸性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清中和抗体效价等免疫指标及疫苗保护效果进行测定。结果显示,免疫组红、白细胞数量迅速上升,于免疫后第4天达峰值,分别为(8.50±0.17)×10~8个/mL和(8.96±0.44)×10~6个/mL;单核细胞和嗜中性粒细胞分类百分比于第7天达峰值,分别为10.50%和15.53%,极显著高于对照组(P0.01),淋巴细胞分类百分比在第21天才达峰值73.51%;吞噬指数和吞噬百分比均于第4天达到最高值,分别为4.53和30%;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性分别在免疫后第7天和第14天达到峰值,极显著高于对照组(P0.01);血清抗体效价于免疫后第21天达到峰值1:203,极显著高于对照组(P0.01)。攻毒感染实验结果表明,免疫组的相对免疫保护率为76.84%。由此可见,嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后,能够显著诱导施氏鲟体内的免疫应答反应,增强鱼体的免疫保护能力。本研究为养殖鲟因嗜水气单胞菌感染引起疾病的免疫预防技术研究奠定了前期基础。     

斑点叉尾 源嗜麦芽寡养单胞菌的脂质体疫苗研究

采用反相蒸发法制备嗜麦芽寡养单胞菌的脂质体疫苗,通过灌胃分别给予各组斑点叉尾(鮰)(Ictalurus punctatus)脂质体疫苗(Ⅰ-Ⅲ组)、嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗(Ⅳ组)和生理盐水(Ⅴ组),每2周给药1次,共3次.于接种疫苗后第1天、14天、28天和第49天采集静脉血,测定白细胞的杀菌活性和血清抗体IgM含量的变化,并用细菌攻毒实验检测免疫保护效应.结果显示,本实验制备的脂质体疫苗粒径约为(0.9±0.3)μm,包封率为53.23%,与嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗相比能显著增强斑点叉尾(鮰)吞噬细胞的杀菌活性和血清抗体:IgM水平.腹腔注射活菌攻毒后,脂质体疫苗免疫的Ⅰ-Ⅲ组的相对免疫保护率分别为34.8%、48.2%和55.4%;而嗜麦芽寡养单胞菌灭活苗免疫的Ⅳ组的相对免疫保护率仅有6.7%,生理盐水对照Ⅴ组保护率则为零.研究表明,口服脂质体疫苗对斑点又尾(鮰)具有显著的免疫保护效应,可作为预防嗜麦芽寡养单胞菌感染的疫苗.     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响

为研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)灭活疫苗对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(250 g±12 g)免疫力和抗病力的影响,给试验鱼腹腔注射0.2 mL的灭活嗜水气单胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)。分别在注射前(0 d)和注射后7、14、21、28、35、42 d取样,测定血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶(LZM)活力、补体C3含量以及头肾和脾脏中IgM、IgT基因表达情况。结果表明:注射嗜水气单胞菌疫苗能显著提高白细胞吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)、LZM活力和补体C3含量,注射后21 d达峰值,PI、LZM和补体C3在42 d仍显著高于对照组。免疫后21 d头肾和脾脏中IgM基因上调表达,35 d达峰值(分别上升24倍和26倍),42 d下降但仍极显著高于对照组。头肾和脾脏中IgT的上调表达比IgM弱得多,头肾35 d达峰值(上升6.2倍),脾脏28 d达峰值(上升6.1倍)。免疫42 d后嗜水气单胞菌攻毒结果表明,嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用,免疫保护率达到71.43%。     

褐牙鲆腹水症病原菌的分离鉴定及其灭活疫苗的研制

从患腹水病褐牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化和分子生物学方法进行鉴定;该菌的16S rDNA序列与标准株同源性达99.8%,证明该菌为嗜水气单胞菌.制备灭活疫苗后分别注射小鼠和牙鲆,测定其免疫效果.试验结果表明,用所制备的灭活疫苗免疫小鼠,其保护率达到90%,免疫牙鲆的保护率达到80%;采用渗透压差法浸泡免疫牙鲆在攻毒后发病率仅为6%,攻毒后保护率为85%;通过间接ELISA检测表明受免动物体内产生了较高水平的抗体;剖检及病理切片结果表明免疫过的动物内脏健康无异样,而未免动物肝脏充血,肠腔有积水.说明该疫苗安全有效.     

中华鳖气单胞菌菌细胞苗和菌化学成份疫苗研制

利用分离自中华鳖的嗜水气单胞菌Ａｈ９６１００４、Ａｈ９６０９１６和Ａｈ９７０５１６与温和气单胞菌Ａｓ９７０５１０菌体及其上清制备灭活苗细胞苗和化学成份疫苗。肌肉注射中华鳖进行免疫,加强免疫１５ｄ后,用菌株Ａｈ９６１００４腹腔注射进行攻击,观察２０ｄ。结果表明,温和气单胞菌Ａｓ９７０５１０株的菌苗及其胞外分泌物（ＥＣＰ）苗组和嗜水气单胞菌Ａｈ９６１００４株的外膜成份组对嗜水气单胞菌的攻击的保护率最高     

一种佐剂新材料在嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫中的应用效果

为研究蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷(CPMG)在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的佐剂作用,将CPMG和嗜水气单胞菌灭活疫苗联合施用,二次浸泡免疫异育银鲫后饲养在室内玻璃缸中,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测加强免疫后2、4、7、11、14和21 d脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素和溶菌酶的m RNA表达量,首次免疫30 d后用同源菌株活菌攻击实验鱼;同时,用含CPMG、山莨菪碱复合佐剂的灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫一次后饲养在池塘网箱中,定期抽取血液检测血清抗体效价并用同源菌株人工感染实验鱼。结果显示,CPMG佐剂组和无佐剂组的5个免疫相关基因的相对表达量显著高于对照组,CPMG组Ig M基因较无佐剂组更早表达,补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的基因表达量更高或表达持续时间更长。血清抗体效价在免疫后2周达到160,6周达到峰值640,12周降低为40。室内玻璃缸中二次免疫30 d后,CPMG组的平均相对保护率达到70.6%,复合佐剂组达到88.2%,均显著高于无佐剂组的56.0%。池塘网箱中一次浸泡免疫30、60和120 d后,平均相对保护率分别为54.6%、44.0%和12.5%。研究表明,CPMG与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫异育银鲫,增强了脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高了异育银鲫抗嗜水气单胞菌感染的能力。     

酵母免疫多糖对受免斑点叉尾免疫应答的增强作用

在饲料中添加定量的酵母免疫多糖,投喂注射接种了福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)菌苗的斑点叉尾(Ictalurus punctatus),28 d后通过测定供试鱼的增重量、血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、谷丙转氨酶活性(SGPT)、血清总蛋白含量、白细胞吞噬活性以及活菌攻毒后的免疫保护率(RPS),探讨了酵母免疫多糖对受免斑点叉尾免疫应答的增强作用。结果表明,用添加200.0 mg/(kg.d)酵母免疫多糖的饲料投喂受免斑点叉尾,不仅可以使受免斑点叉尾对灭活嗜水气单胞菌的免疫应答水平提高,增强抵抗嗜水气单胞菌人工感染的能力,而且还具有一定的促进生长和改善肝功能的作用。     

Immune protection in carp, Cyprinus carpio L., after immunization with Aeromonas hydrophila crude lipopolysaccharide

Abstract. Vaccination with crude lipopolysaccharide (LPS) induced better protection against infection with Aeromonas hydrophila in carp than vaccination with formalin killed vaccine. Dipping fish in vaccine for 2 h at 25°C was more effective than intraperitoneal injection of the vaccine in procedural simplicity, lower stress loading and the degree of protection acquired. In carp immunized with crude LPS by the dip method, antibodies were not detected by bacteriai agglutination, passive haemagglutination and the agar diffusion tests. The results indicate that the protection against A. hydrophila infection in carp is not dependent on humoral immunity.     

两种鲤鱼对侵袭性病原体及嗜水气单胞菌抗病力的比较

调查同塘饲养的高寒鲤,散鳞镜鲤当年鱼对侵袭性病原体及人工感染嗜水气单胞菌耐受力进行比较,侵袭性病原体检出8种,其中绦虫只有散鳞镜鲤感染,感染率达到29％,其余种类二种鲤鱼体表,鳃都有寄生,但寄生的程度有所不同,高寒鲤的抵抗力要比散鳞镜鲤强,对人工感染的嗜水气单胞菌的耐受力高寒鲤比散镜鲤高,这可能与品种对病原菌耐性不同有关。     

水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析

对15株分离自甲鱼、草鱼、鲫鱼、石蛙、团头鲂和三角鲂的嗜水气单胞菌,用K-B纸片法对18种抗生素进行药敏试验后,用NCCLS标准进行判断,结果输入WHONET5.4耐药监测软件,比较15株菌的耐药水平及18种抗生素的耐药率,并对四环素和强力霉素表现出来的交叉耐药性进行分析,结果表明,15株嗜水气单胞菌耐药现象较为严重,恩诺沙星、四环素、强力霉素和利福平耐药率均超过40%,WHONET5.4散点图表明四环素和强力霉素有较为密切的交叉耐药现象。     

Dominant pathogenic species of mesophilic aeromonads isolated from diseased and healthy fish cultured in Poland

Aeromonas isolates were collected from cultured fish, characterized phenotypically and identified to species using 16S rDNA. The pathogenicity of all isolates was assayed on the basis of haemolytic and proteolytic activity and challenge tests were performed for isolates from healthy fish. A total of 131 Aeromonas isolates were obtained and identified as follows: A. hydrophila (13), A. bestiarum (23), A. salmonicida (motile biogroup) (19), A. caviae (2), A. sobria (18), A. veronii bt. sobria (42), A. jandaei (1), A. encheleia (11) and A. allosaccharophila (2). All isolates of A. hydrophila and A. bestiarum and most isolates of A. salmonicida and A. veronii were classified as pathogenic. Aeromonas hydrophila was isolated only from diseased trout except for one isolate obtained from carp fry. The other potentially pathogenic Aeromonas species were present in diseased as well as healthy fish. The pathogenicity of isolates from healthy fish was correlated with their enzymatic activity and was also tested by challenge experiments. The dominant pathogenic species were A. veronii bt. sobria, A. bestiarum and A. salmonicida in common carp and A. hydrophila in rainbow trout.     

投喂阿维拉霉素对鲤免疫应答的影响

将阿维拉霉素按照一定的浓度添加到饲料中,投喂经注射接种福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aerom onashydrophila)菌苗的鲤,于免疫后的第7 d、14 d、21 d、28 d和35 d检测供试鲤血液中的白细胞吞噬活性、血清中溶菌酶活性、抗体效价、补体C3含量及免疫保护率(RPS),探讨了阿维拉霉素对受免鲤免疫应答的影响。结果表明,饲料中添加阿维拉霉素(4 mg/kg和8 mg/kg),投喂较长时间(≥28 d)会降低受免鲤的血液白细胞吞噬活性、血清中的溶菌酶活性和抗体效价,减少受免鲤血清中补体C3的含量,减弱鲤抵抗嗜水气单胞菌人工感染的能力,每公斤饲料中添加8 mg的阿维拉霉素其免疫抑制作用更强。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的研究

从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2 株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子、16S rRNA基因序列的测定及药敏试验,研究分离菌的生理生化特征、致病性及药物敏感性.根据2 株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),确定为嗜水气单胞菌.人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又分离到该菌株.2 株菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟等15 种药物均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出菌株差异.对其敏感的15 种药物可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物.     

Cell-mediated protection in carp, Cyprinus carpio L., against Aeromonas hydrophila

Abstract. The mechanism of protection against Aeromonas hydrophila infection in carp was studied. Recipient fish, into which pronephric cells from carp previously immunized by dipping in bacterial crude lipopolysaccharide (LPS) at 25°C for 2h were transferred, demonstrated almost the same level of protective ability as an immunized control group. The protective ability was transmitted by non-adherent (to nylon fibre) immune pronephric cells. These non-adherent cells were damaged by anti-carp thymocyte serum and were, thus, considered to be T-like cells. The protective ability was depressed in immunized carp treated with anti-carp thymocyte serum in vivo and was also remarkably reduced in immunized carp whose macrophage function was impaired by Dextran sulphate-500 treatment. These results indicate that the protection shown by carp immunized by dipping in crude LPS is dependent on cellular immunity regulated by a T-like cell-macrophage system.     

Isolation and characterization of fish Aeromonas hydrophila adhesins important for in vitro epithelial cell invasion

The molecular mechanisms involved in the invasion of Aeromonas hydrophila (strain PPD 134/91) into host cells were studied in vitro using a carp epithelial cell line. Bacterial fractions were extracted with potassium thiocyanate (KSCN) to investigate the adhesins involved. Two groups of adhesins were found. The major group was high molecular weight proteins with the largest component being a 43-kDa protein. Amino terminal sequence analysis indicated that this may have been an outer membrane porin. This supports previous suggestions that a 43-kDa outer membrane protein may be important in adhesion of a human isolate of A. hydrophila . The minor group of adhesins were low molecular weight proteins likely to be less effective in mediating bacterial adhesion and invasion into carp epithelial cells.     

银鲫肠道内抑制嗜水气单胞菌的潜在益生菌筛选及其特性研究

从养殖的银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道中分离纯化得到60株具有不同特征的菌株,以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为指示菌,点种法初筛得到12株菌株,再通过牛津杯实验筛选出4株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用(抑菌圈直径在14 mm以上)的益生菌疑似株,并进行了耐热试验、耐酸试验和人工肠液耐受试验,筛选出最符合益生菌功能特性的菌株YJ-9。该菌株在90℃高温水浴30 min后相对存活率为1.51%,在pH3的液体培养基中4 h内相对存活率为8.37%,活菌数都保持在106 CFU/mL以上,并且可以在人工模拟肠液中缓慢生长。在急性毒力实验中,10倍于实验剂量的菌株YJ-9对银鲫无毒,动物保护实验证明菌株YJ-9能有效增强银鲫对嗜水气单胞菌的免疫抵抗力,相对保护率达到80%。研究结果表明,菌株YJ-9可以作为一个新的饲用微生态制剂候选菌种。