家蚕酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

[目的]了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶(PNP0)的基因结构.[方法]利用生物信息学原理和PeR方法,克隆出编码家蚕(Bombyx mori)PNPO的cDNA(GenBank登录号:DQ452398);采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达,并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定;依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA,对家蚕PNPO基因结构进行分析.[结果]克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框,编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质.序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性,包含PNPO家族共有的保守序列,但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换.在以磷酸吡哆醇(PNP)为底物时,表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol·min-1·mg-1.家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子,跨越3.5 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5'端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序.[结论]获得家蚕PNPO基因,可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征,弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律.     

家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP25转录分析及其免疫响应

[目的]分析家蚕丝氨酸蛋白酶(SP)基因序列BmSP25及转录情况,明确其表达规律对防御家蚕核型多角体病毒(BmNPV)入侵的免疫应答机制,为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据.[方法]克隆BmSP25基因序列,对该基因编码蛋白的氨基酸序列、分子量、结构域等进行生物信息学分析;利用GeneDoc和MEGA 5.0对BmSP25氨基酸序列进行多序列比对及系统发育进化树分析,采用半定量RT-PCR对家蚕不同组织和发育时期的BmSP25基因转录情况进行分析,并以实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在BmNPV感染家蚕中肠组织中的转录水平.[结果]BmSP25基因的ORF全长885 bp,编码294个氨基酸,其中第1~17位氨基酸为信号肽,去信号肽的分子量为29.1 kD,理论等电点为7.8.BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成;其氨基酸序列同源性比对分析发现,BmSP25(BGIBMGA008514-PA)与蓓带夜蛾SP序列(GenBank登录号ADM35105)的同源性最高,为62.1%.BmSP25基因在家蚕中肠组织中特异表达,且在整个幼虫时期呈持续性表达.BmSP25基因在家蚕感染BmNPV后发生明显变化,至感染6 h时呈下调趋势,而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达.[结论]BmSP25在防御BmNPV入侵家蚕的免疫应答过程中发挥重要作用.鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点,因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫.     

鸡传染性支气管炎病毒山东株的遗传变异分析

采用RT-PCR方法对1株传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)Chicken-SD-E-04的S1和N基因进行扩增、克隆测序.通过序列分析发现:该分离株的N基因相对较为保守,与参考毒株的氨基酸同源性在87.1%～91.2% ;从N基因的遗传关系树上分析显示Chicken-SD-E-04与其他多数分离株间及疫苗株的遗传距离较远.而就S1基因而言,分离株与参考毒株的氨基酸同源性在73.2%～80.1% ;从S1基因的遗传关系树上分析发现Chicken-SD-E-04与疫苗株的遗传距离较远,且处于不同的分支上.其结果说明这株山东分离株具有明显的地域性;而且也从分子水平上证实了目前山东流行毒株与传统疫苗株的遗传距离较远.     

家蚕核酸糖转运蛋白BmSlc35b3基因的克隆与序列分析

在电子克隆的基础上,利用RT-PCR方法克隆了家蚕的同源基因BmSlc35b3(GenBank登录号:GU244352)。生物信息学分析结果显示,该基因编码区长1128bp,包含5个外显子,由基因推定的蛋白质由375个氨基酸组成,内有9个跨膜结构域,8个N-糖基化位点,与家蚕溶质运载蛋白家族B3(ABD36159)有4个氨基酸的差异,与赤拟谷道(EFA00972)、金小蜂(XP_001601459)、致倦库蚊(EDS30138)、疟蚊(EAA11308)等的同源性均在70%以上。RT-PCR对BmSlc35b3基因在五龄3d家蚕幼虫9种组织中的表达进行检测,结果表明,其在中肠和精巢中表达,在其他组织中不表达。     

凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ型基因4种不同剪切体的序列分析

采用RT-PCR技术克隆了凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ基因全长编码序列,对其核苷酸序列和编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析,并在对虾肌钙蛋白Ⅰ基因的编码区查找了单核苷酸多态性位点。结果显示：本研究克隆获得了凡纳滨对虾肌钙蛋白Ⅰ基因的4个可变剪切体,其编码的蛋白质均具有Troponin超家族结构域特征,同源性比对发现该蛋白的氨基酸序列在节肢动物中高度保守。系统进化分析发现凡纳滨对虾Tn-Ⅰ3和Tn-Ⅰ4与中国对虾和小龙虾的Tn-Ⅰ遗传距离较近,而Tn-Ⅰ1和Tn-Ⅰ2单独聚为一支,且与其他物种Tn-Ⅰ遗传距离较远;通过测序比较不同个体凡纳滨对虾Tn-Ⅰ基因序列发现在Tn-Ⅰ的4种不同剪切体编码区共同序列区第302位和472位碱基分别存在2个（A/G） SNP位点,其中位于第302位碱基的（A/G）错义突变使编码氨基酸由甘氨酸变为了谷氨酸（G/E）。凡纳滨对虾Tn-Ⅰ基因不同剪切体及编码区错义突变的发现为进一步探讨其基因功能奠定了基础。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

【目的】了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（PNPO）的基因结构。【方法】利用生物信息学原理和PCR方法,克隆出编码家蚕（Bombyx mori）PNPO的cDNA（GenBank登录号：DQ452398）;采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达,并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定;依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA,对家蚕PNPO基因结构进行分析。【结果】克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框,编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性,包含PNPO家族共有的保守序列,但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换。在以磷酸吡哆醇（PNP）为底物时,表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol•min-1•mg-1。家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子,跨越3.5 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5’端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。【结论】获得家蚕PNPO基因,可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征,弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律。     

4株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及其全基因组序列分析

为探讨4株鸽源Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type1,PPMV-1)分离株的遗传起源和基因Ⅵ型PPMV-1全基因组氨基酸序列特征性的变化,对江苏省2007—2008年临床发病鸽中分离鉴定出的4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行全基因组序列分析比对。结果表明,分离的4株PPMV-1分离株均属于Ⅵb型,且与欧洲流行株EU/re亚型遗传距离最近,而与中国流行株遗传距离较远;氨基酸序列分析发现,在核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、大分子蛋白(L)中分别有1个基因Ⅵ型PPMV-1序列特征的氨基酸突变。     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇(Drosophila melanogaster)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(AAN09371)氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列.家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶(bmgapdh)基因长1 485 bp(N0:DQ202316),包括5'UTR 221 bp,3'UTR 265 bp和完整的999 bpORF框,编码333个氨基酸残基.用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91%,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71%.bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包舍3个外显子.3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).推导的氨基酸序列N端包含与NAD+结合的保守结构域:ASCTTNCL.     

椰子织蛾CSP基因的克隆与序列分析

利用rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技术,克隆获得了1条椰子织蛾(Opisina aremosella)的全长化感蛋白基因序列。该基因全长为561 bp,开放阅读框全长为393 bp,3′和5′端非编码序列分别为48、120 bp,编码130个氨基酸,所编码蛋白质的理论分子量为14.8 ku,等电点为5.85。同源性比对分析发现,椰子织蛾化感蛋白基因氨基酸序列有4个保守半胱氨酸位点且与其他昆虫化感蛋白基因在氨基酸的水平上相似性不高。除与棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)相似度达71%外,与其他昆虫相比,均低于10%。SignalP预测显示,椰子织蛾化感蛋白基因所编码的前20个氨基酸为信号肽序列(MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG)。系统进化树分析结果表明,椰子织蛾化感蛋白与稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和家蚕(Bombyx mori)化感蛋白1、2、3、4聚为同一族,与家蚕化感蛋白1、2、3、4的进化程度最近。这为深入研究昆虫化学感受蛋白、揭开昆虫与环境化学信息联系的规律奠定理论基础。     

奥尼杂交罗非鱼及其亲本热休克蛋白Hsp70基因cDNA序列克隆与比较分析

为探讨杂交罗非鱼抗应激遗传能力及其与亲本之间关系,采用RT-PCR方法克隆了奥尼杂交罗非鱼及其亲本热休克蛋白Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)的cDNA序列.序列分析结果表明:杂交奥尼罗非鱼及其父本奥利亚罗非鱼和母本尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因CDS均为1923 bp,编码640个氨基酸,含有84个碱性氨基酸,95个酸性氨基酸,理论等电点为5.462.通过antheprot分析发现Hsp70家族的3个签名序列分别为 IDLGTTYS,IFDLGGGTFD,VVLVGGSTRIPKIQK,核定位信号标签:KRKHKKDISQNKRALRR,Dank特征基序DLGTT-S-V,胞质Hsp70特征基序EEVD,靠近C端的GGMP4肽序列,另有2个糖基化位点NKSI和NVSA.奥尼杂交罗非鱼与其亲本Hsp70的序列比对发现,奥尼杂交罗非鱼Hsp70的核苷酸(100%)和氨基酸序列(99.8%)与父本奥利亚罗非鱼基本一致,与母本尼罗罗非鱼有2个氨基酸不同,5个核苷酸突变位点;与母本尼罗罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、青鳉、牙鲆氨基酸序列同源性分别为99.5%、99.4%、93.1%、83.9%.系统发育树分析表明奥尼杂交罗非鱼与父本奥利亚罗非鱼距离最近,与母本尼罗罗非鱼距离远,该结果与传统杂交罗非鱼偏父本遗传结论相符.