家蚕磷酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

 【目的】了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（PNPO）的基因结构。【方法】利用生物信息学原理和PCR方法，克隆出编码家蚕（Bombyx mori）PNPO的cDNA（GenBank登录号：DQ452398）；采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达，并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定；依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA，对家蚕PNPO基因结构进行分析。【结果】克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框，编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性，包含PNPO家族共有的保守序列，但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换。在以磷酸吡哆醇（PNP）为底物时，表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol•min-1•mg-1。家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子，跨越3.5 kb DNA序列，所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则，基因的5’端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。【结论】获得家蚕PNPO基因，可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征，弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律。