EGF·Insulin和IGF-I对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响

探讨了培养基中不同浓度血清情况下,分别添加不同浓度的表皮生长因子（EGF）、胰岛素（Insulin）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对食蟹猴耳部成纤维细胞体外增殖的影响,目的是寻找这3种物质促进体外培养成纤维细胞的最佳浓度,改善细胞体外培养系统,为以后体细胞及干细胞培养提供参考。将处于对数生长期的10～15代细胞进行常规消化混匀,计数,接种,培养24h后分别向孔中加入含5％和10％的两种血清浓度、添加不同浓度的EGF、Insulin和IGF-I的培养基,6d后分别向孔中加入MTT,然后用酶联免疫检测仪测定各孔在492nnl处的吸光度值（0D）。血清浓度为10％情况下,培养基中添加10ng／ml EGF、10μg／ml Isulin、100ng／ml IGF-I时,食蟹猴耳部成纤维细胞增殖能力最好。     

食蟹猴支持细胞的分离、纯化以及不同血清浓度对其增殖的影响研究

[目的]纯化培养食蟹猴支持细胞,并测定不同血清浓度对细胞增殖的影响。[方法]分离并纯化食蟹猴支持细胞后,分别以5%、10%、15%、20%4种不同血清浓度的培养基对食蟹猴支持细胞进行培养。利用MTT比色法判断支持细胞的增殖情况,从而确定最佳的血清培养浓度。[结果]5%血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与10%血清浓度的培养基差异不显著,15%与20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异不显著,5%、10%与15%、20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异极显著。[结论]15%的血清浓度是支持细胞增殖的最佳比例。     

广西地区人工饲养雌性食蟹猴雌二醇和睾酮含量变化的研究

探索广西地区人工饲养的雌性食蟹猴在少年、青年和中年阶段睾酮和雌二醇分泌情况。使用放射免疫方法分别测定血清中的睾酮、雌二醇含量变化。试验结果表明：广西地区人工饲养的雌性食蟹猴少年组、青年组和中年组间雌二醇分泌的量分别是38.81±21.57 pg/ml、76.09±56.23 pg/ml、64.37±39.48 pg/ml,分泌水平差异极显著（P〈0.01）,其中青年组雌二醇分泌量大于中年组,少年组的含量最少。雌性食蟹猴少年组、青年组和中年组间睾酮的分泌量分别是52.36±24.93 ng/ml,37.95±21.69 ng/ml、80.91±29.19 ng/ml,分泌水平差异极显著（P〈0.01）,其中中年组分泌水平最高,青年组其次,少年组最少。     

食蟹猴-猪异种体细胞核移植胚胎的构建

[目的]探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础.[方法]以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MⅡ期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化.[结果]70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂（70.0％）,与猪同种核移植胚胎的分裂率（76.6％）无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带（350 bp）;食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1h的染色体早熟凝集率（24.2％）显著低于猪同种核移植胚胎（44.7％）和猪孤雌激活胚胎（100.0％）,通过使用无Ca2＋融合液能够显著提高染色体早熟凝集率（48.2％）;在PZM-3、HECM-10和HECM-10＋10％ FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异.[结论]食蟹猴体细胞核能够在猪MⅡ期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段.     

广西地区食蟹猴配种后主要生殖激素的变化

[目的]探讨广西地区笼养雌性食蟹猴配种后生殖激素的变化水平。[方法]采用放射免疫分析法（RIA）测定食蟹猴配种后血清雌二醇（E1）、孕酮（P）和催乳素（PRL）的水平变化。[结果]结果表明,在配种后1～60d孕酮的含量缓慢降低,第60天降到最低水平（0．22±0．06）ng／ml,其后缓慢上升。第105天出现一个大的峰值,为（1．15±0．12）ng／ml,峰值过后浓度呈下降趋势,整个测定时期的平均值为（0．66±0．08）ng／ml。雌二醇的含量除了在第75天有一个较大的峰值[（86．92±18．54）pg/ml]外一直处于一个稳定的水平,在第120天后呈逐渐上升的趋势,整个测定时期的平均值为（35．16±5．12）pg／ml。催乳素的含量在配种后1～90d稳步上升,第90天出现一个小的峰值,为（99．62±44．56）IU／ml。第105天后含量上升较快,催乳素在整个测定时期的平均值为（103．64±37．36）IU／ml。[结论]该研究为采用食蟹猴作为动物模型探讨不孕不育的病因和发病机理提供参考依据。     

Roscovitine同期化供核细胞对猴—猪异种核移植胚胎发育的影响

[目的]探讨Roscovitine同期化供核细胞对食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为提高灵长类的核移植效率奠定基础.[方法]活体采集4岁雄性食蟹猴的耳组织,经组织块培养获得纯化的食蟹猴耳成纤维细胞,细胞经固定、染色后用流式细胞仪分析细胞周期分布.以不同同期化方法处理的食蟹猴耳纤维细胞为供体细胞,以体外成熟、去核的猪卵母细胞为受体细胞,利用电融合法构建食蟹猴—猪异种核移植胚胎,观察异种核移植重构胚胎的体外发育情况.[结果]以15 μmol/L Roscovitine处理食蟹猴耳成纤维细胞24、48、72 h获得的G0/G1期细胞比率分别为76.51％、89.69％和90.49％,其中处理48和72h的G0/G1期细胞比率显著高于对照组（P＜0.05）.血清饥饿、接触抑制72 h同期化获得的G0/G1期细胞比率分别为91.12％和90.46％.Roscovitine同期化处理食蟹猴耳成纤维细胞48 h可有效提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率（15.05％）,显著高于血清饥饿同期化处理和接触抑制同期化处理的效果（P＜0.05）.[结论]Roscovitine可有效同期化食蟹猴耳成纤维细胞在G0/G1期,最终提高食蟹猴—猪异种核移植重构胚胎的囊胚形成率.     

小檗碱／IGF-Ⅰ对猪体外受精胚胎发育作用初探

【目的】初步探讨小檗碱(Berberine,Ber)和胰岛素样生长因子I (Insulin like growth factorI,IGF-I)对猪体外受精胚胎发育效果的作用。【方法】通过在NCSU-23基础培养液中添加IGF-I (50、100、150ng/mL),筛选出最佳质量浓度;以添加Ber (0.1μg/mL,Ber组)、最佳质量浓度的IGF-I (IGF-I组,100ng/mL)和同时添加二者(Ber+IGF-I组)为三个试验组,观察猪体外受精胚胎的发育效果,并检测各组别IGF-I、IGF-IR(Insulin-like growth factor I recepter,胰岛素样生长因子I受体)转录水平。【结果】IGF-I 100、150ng/mL组胚胎各时期发育率均极显著高于对照组和50ng/mL组(P0.01),100ng/mL与150ng/mL组之间无显著差异(P0.05),最佳质量浓度为100ng/mL;Ber组、IGF-I组、Ber+IGF-I组胚胎各时期发育率、IGF-I、IGF-IR转录水平均极显著高于对照组(P0.01),但三组之间均无显著差异(P0.05)。【结论】Ber和IGF-I可显著提高猪体外受精胚胎发育率,提高其内源性IGF-I、IGF-IR基因转录水平,但同时添加二者与单独添加相比并无显著变化,推测二者可能参与介导同一个信号通路,有待进一步研究。     

表皮生长因子(EGF)对绵羊体外培养毛囊的影响

分别采用100ng/m l,20ng/m l,2ng/m l,0.2ng/m l浓度梯度和对照组,对表皮生长因子(EGF)对绵羊毛囊形态影响及生长调控机理作了初步研究,结果表明:EGF促毛囊生长随浓度的增加而降低,促毛囊生长的最适浓度为20ng/m l,2-20ng/m l促生长作用明显,100ng/m l对毛囊生长有抑制作用,20ng/m l EGF和10ng/m l IGF-I联合作用促毛囊生长达到高峰。20ng/m l EGF及与10ng/m l IGF-I二者联合对体外培养毛囊生长长度与培养天数呈明显的正相关,以0.122和0.183的斜率较恒定的刺激毛囊的生长,直到第8d后毛囊的生长速度才明显降低。     

生长因子和体细胞共培养对牛体外受精的影响

为研究表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对牛卵母细胞体外发育的影响以及体细胞共培养对体外受精胚胎体外发育的影响,将获取的牛卵泡卵母细胞在含有30μg,LEGF或50mg／L Insulin或30μg／LEGF＋50mg／L Insulin的成熟培养液中进行成熟培养,比较不同生长因子对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响;将受精卵用颗粒细胞单层培养系统或牛输卵管上皮细胞单层培养系统进行体外培养,比较体细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30μg／LEGF或者30μg／LEGF＋50mg／L Insulin可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率（P〈0．05）;输卵管上皮细胞共培养系统可以显著提高受精后的囊胚发育率（P〈0．05）,可以用于牛体外受精胚胎的体外培养。     

广西人工饲养雄性食蟹猴睾酮分泌水平分析

[目的]探讨广西人工饲养雄性食蟹猴在不同年龄段的睾酮分泌情况,为解决人工饲养食蟹猴的繁殖问题提供基础科研资料.[方法]以2岁11月龄（少年）、4岁2月龄（青年）、6岁10月龄（中年）3组健康雄性食蟹猴为研究对象,于秋冬季节（2008年10月22日～2009年3月6日）采集血样,用放射免疫分析法测定其血清睾酮水平变化.[结果]广西人工饲养雄性食蟹猴在不同年龄阶段的睾酮分泌水平存在显著差异（P＜0.05）,表现为：中年雄性食蟹猴（84.94±52.29 ng/mL）＞青年雄性食蟹猴（72.44±20.13 ng/mL）＞少年雄性食蟹猴（56.84±15.32 ng/mL）.环境温度与雄性食蟹猴睾酮分泌水平的相关系数分别为：少年组0.77、青年组0.92、中年组0.75,其中,青年组的相关性极显著（P＜0.01）,少年组和中年组的相关性不显著（P＞0.05）.[结论]广西人工饲养雄性食蟹猴睾酮分泌水平因性功能年龄的改变而呈显著差异,环境温度仅是影响雄性食蟹猴睾酮水平的可能因素.     

食蟹猴耳部成纤维细胞体外培养体系的初步建立

建立食蟹猴耳部成纤维细胞的体外培养体系,为食蟹猴体细胞核移植、转基因技术及治疗性克隆做准备.通过组织块培养法进行原代培养,成功分离了食蟹猴耳部成纤维细胞;原代培养后用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液消化细胞,用含10%FBS的DMEM对细胞进行培养,细胞在体外传至第25代;用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液对细胞进行冷冻保存,解冻传代后,细胞形态和生长速度没有明显变化;用细胞技术法绘制细胞的生长曲线显示,符合体外细胞生长规律;用吉姆萨染色法对不同代数细胞的染色体倍性进行分析,二倍体细胞所占比例为80%以上.     

牛小腔前卵泡体外生长发育的研究

 在添加有ITS、丙酮酸钠、次黄嘌呤、血清、FSH、LH、E2的α-MEM基础液中加入表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维生长因子(bFGF)及氢化可的松（HC），对直径＜100 ?m（平均直径61～70?m）的牛小腔前卵泡进行体外培养。结果表明，试验I，在FSH、LH、E2浓度分别为0.25 ?g·ml-1、5 iu·ml-1、0.5 ?g·ml-1时，卵泡体外培养7 d， EGF和bFGF联合存在好于分别单独存在时的培养效果，当bFGF（25 ng或50 ng）剂量保持不变，提高EGF含量（25 ng,50 ng）有抑制卵泡发育的作用；增加bFGF的剂量有助于腔前卵泡的发育。 试验II，当FSH、LH、E2分别调整到4 ?g·ml-1、10 iu·ml-1、0.1 ?g·ml-1，并添加了氢化可的松（40 ng·ml-1），卵泡体外培养13 d，在试验3组（EGF 25ng）和试验4组（EGF 25 ng+ bFGF 50 ng），卵泡发育率和卵泡平均增长直径均显著好于试验1组（未添加EGF、bFGF、氢化可的松）和试验2组（只添加氢化可的松）。体外培养第20 d，试验3组和试验4组卵泡发育率分别为15.79 %和25.58 %，卵泡最大增长直径分别为300和320 ?m，并形成小的卵泡腔（成腔率分别为7.69 %和17.65 %），而试验1组和试验2组其卵泡发育率均为0。表明体外培养腔前卵泡时，不同的培养体系对其生长发育有十分重要的影响，各种成分之间存在互作的关系。     

HMG、EGF和TGF-α对猪卵母细胞体外成熟及孤雌发育的影响

以TCM199为基础培养基,HMG(尿促性素)为激素,研究了HMG对猪卵母细胞体外成熟(IVM)和发育的影响;同时对EGF(表皮生长因子)和TGF-α(转化生长因子-α)单独或联合使用对猪卵母细胞IVM及发育的影响进行了研究,以确立较好的猪卵母细胞IVM培养体系.结果表明:(1)在猪卵母细胞IVM中分别添加0.075 IU/ml、0.150 IU/ml、0.200 IU/ml、0.300 IU/ml的HMG,其中添加0.200 IU/ml的HMG组卵母细胞的成熟率和激活后的卵裂率显著高于其它组(P<0.05);(2)添加50 ng/ml EGF组成熟率和卵裂率显著高于对照组和添加30 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml组(P<0.05);(3)添加15 ng/ml TGF-α组成熟率显著高于对照组和添加5 ng/ml、40 ng/ml组(P<0.05),激活后添加15 ng/ml组卵裂率显著高于其他组(P<0.05),当TGF-α的浓度高于15 ng/ml后对卵母细胞的成熟和激活后的卵裂没有显著的提高作用(P＞0.05);(4)同时添加EGF和TGF-α组成熟率和卵裂率与对照组相比差异显著(P<0.05),但与添加50 ng/ml EGF、15 ng/ml TGF-α组相比没有明显差异(P>0.05).可见EGF和TGF-α对猪卵母细胞的IVM和激活后的卵裂没有明显的协同作用.     

采集方法、EGF对山羊卵母细胞体外成熟的影响

采用抽吸法、切剖法、刺破法采集山羊卵母细胞。抽吸法得到的卵母细胞数最多,但花费时间最多且裸卵较多,不适合回收卵母细胞。切剖法与刺破法差异不显著,但切剖法所用时间多于刺破法,两者差异显著（P〈0.05）。添加20、30、50 ng/ml表皮生长因子（EGF）于卵母细胞培养液中与对照组相比,20 ng/ml EGF对卵母细胞的成熟没有显著影响;30 ng/ml EGF可显著促进卵母细胞的成熟（P〈0.05）,50 ng/ml EGF可极显著促进卵母细胞的成熟（P〈0.01）。     

计算机辅助精液分析系统对食蟹猴精液的分析

[目的]用计算机辅助精液分析系统（CASA）对食蟹猴精液进行分析,以揭示食蟹猴的精液生物学特性。[方法]采用CASA系统对29例雄性食蟹猴精液样本进行分析。[结果]静态特性：食蟹猴的精子密度为（2 134.53±2 052.87）M/ml;活动精子密度为（1 955.36±1 939.59）M/ml,活动精子百分率为（88.79±9.09）%;前向运动精子密度为（1 263.98±1 271.13）M/ml,前向运动精子百分率为（59.58±16.43）%;快速相细胞百分率为（82.76±13.10）%。食蟹猴精子的平均路径速度为（133.78±58.22）μm/s,直线速度为（121.43±56.64）μm/s,曲线速度为（169.78±52.39）μm/s,精子头侧摆幅度为（4.19±0.72）μm,平均摆跨频率（鞭打次数）为（29.79±4.30）Hz,前向性为（84.62±5.46）%,直线性为（63.62±13.07）%。②食蟹猴精子的快速相浓度为（1 844.97±1 875.96）M/ml,百分率为（82.76±13.10）%;中等相浓度为（110.18±139.33）M/ml,百分率为（5.93±5.26）%;慢速相浓度为（85.74±144.32）M/ml,百分率为（3.62±2.90）%;静止相浓度为（93.99±72.85）M/ml,百分率为（7.69±8.20）%。食蟹猴精子的头长比为（61.93±4.4.14）%;头部面积为（7.33±1.22）μmsq。[结论]该研究为在人工饲养食蟹猴的繁殖实践中进行精液品质鉴定提供依据。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液(含FSH)中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子(EGF),24h后检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明:添加10ng/ml、30ng/mlEGF组牛卵母细胞成熟率较对照组(未添加EGF)无显著差异(79.8%vs71.5%vs70.4%,p>0.05),但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%(P<0.01);在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml、50ng/mlEGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率(P>0.05),但可显著提高其囊胚孵化率(P<0.01)。     

中草药与金霉素对生长猪的影响及其机理初探

75～80日龄体重相近仔猪150头,随机均分3组,每组5个重复,每个重复10只样本,研究中草药饲料添加剂与金霉素影响生长猪生产性能的免疫内分泌机制。以中草药添加剂（1％）和盒霉素（25mg／kg）分别添加饲喂组Ⅰ,Ⅱ猪群,组Ⅲ为对照,各组仔猪注射猪瘟疫苗2头份／头。分别于开始用药当天（d0）、35d（d35）时逐一称重,并各组前腔静脉采血10头,统计各组猪群生产性能,测定血清猪瘟抗体水平和胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF—Ⅰ）、胰岛素（Insulin）和三碘甲腺原氨酸（T3）和甲状腺素（T4）等与生长有关的内分泌激素。结果显示中草药组仔猪在净增重、日增重和增重率及料肉比方面都显著优于金霉素组和对照组猪群,而后2组间差异不显著。试验结束时,中药组猪群血清猪瘟抗体水平、IGF—Ⅰ、Insulin和T4水平显著高于金霉素组和对照组仔猪。表明该中草药添加刑可通过增强仔猪免疫功能．并显著提高仔猪血清IGF—Ⅰ和胰岛素的水平、减缓T4的下降,从而提高仔猪的生产性能,表现出1种整体调节效应。     

补充物类型对婆罗门杂交母牛生产性能、繁殖和生理反应的影响

两试验旨在比较以糖蜜（ML）或以柑桔果肉（CT）为基础补充物、采食饲草的母肉牛生长性能和生理反应。试验1：60头杂交小母牛（婆罗门×安格斯）,每周补充3次糖蜜或柑桔果肉,测定它们的体增重,繁殖性能和血液尿素氮（BUN）、血清葡萄糖、胰岛素、胰岛素样生长因子-I（IGF-I）以及孕酮（P4）的浓度。按照等热量和等氮量计算补充物的添加量。各处理间繁殖性能没有显著差异,但是与添加糖蜜组（0．03g·d^-1）相比,添加柑桔果肉组的平均体增重（0．40g·d^-1）极显著增加（P〈0．01）。补充柑桔果肉组,血清葡萄糖、胰岛素和胰岛素样生长因子-I的平均浓度显著增加（P〈0．05）;补充糖蜜组,尿素氮浓度显著增加（P〈0．05）。     

食蟹猴精液低温保存研究

【目的】探讨食蟹猴精液低温保存液的最佳配方,为食蟹猴精液冷冻保存和品质鉴定奠定基础。【方法】测定生理温度（37℃）、常温（15～25℃）和低温（0～5℃）3种状态下,食蟹猴精子在不同保存液中的存活时间及存活指数。【结果】生理温度（37℃）和常温（15～25℃）下,食蟹猴精子在TALP液中的存活时间分别为12.94±5.57和58.59±40.91 h,存活指数分别为4.88±1.97和24.48±17.94;而低温（0～5℃）下,食蟹猴精子在TRIS液添加20%蛋黄的保存液中存活时间及存活指数分别为596.00±83.35 h和283.05±49.42,显著高于其他处理（P＜0.01）。【结论】TRIS液添加20%蛋黄是食蟹猴精液低温（0～5℃）保存液的最优配方。     

IGF-1和EGF对辽宁绒山羊初级毛囊体外培养的影响

为研究不同剂量的IGF-1和EGF对辽宁绒山羊毛囊体外生长及毛囊形态的影响,采用显微分离法分离绒山羊初级毛囊,分别测定不同浓度IGF-1(0.1,1,10,100ng·mL-1)、不同浓度EGF(0.2,2,20,100ng·mL-1)和联合添加IGF-1与EGF(分别添加10ng·mL-1和20ng·mL-1)对毛囊形态变化及生长长度的影响.结果表明:IGF-1刺激毛乳头和毛母质细胞分裂增殖;EGF促进毛囊外根鞘细胞分化;联合添加刺激毛球部增大.IGF-1和EGF对毛囊体外生长均具有正向调节作用,作用大小与剂量有关,最适宜浓度IGF-1为10ng·mL-1,EGF为20ng·mL-1,10d后生长长度分别达1.075mm和1.117mm;IGF-1(10ng·mL-1)和EGF(20ng·mL-1)联合添加对毛囊生长促进作用优于单独添加,10d后生长长度达1.413mm.