家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef-11基因在病毒感染宿主细胞中的表达特征

杆状病毒晚期表达因子(late expression factor,LEF)是参与病毒基因组DNA复制和病毒基因转录调控的一个重要家族,该家族成员LEF-11为13 k D的小分子蛋白质。通过比对目前已经测序的63种杆状病毒基因组序列,发现LEF-11的编码基因lef-11在除宿主为双翅目昆虫的Cuni NPV外的所有杆状病毒基因组中都存在,暗示lef-11基因可能在包括家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)在内的杆状病毒复制过程中行使重要功能。通过RT-PCR检测和Western blotting分析lef-11基因及其编码蛋白质在Bm NPV侵染的家蚕卵巢培养细胞Bm N中的转录与表达时相,其转录本从侵染后6h开始持续表达,蛋白质从侵染后12 h开始持续表达。当利用DNA聚合酶特异抑制剂阿非迪霉素(aphidicolin)阻断Bm NPV病毒基因组DNA复制之后检测LEF-11的表达受到抑制,暗示LEF-11的表达起始于病毒DNA复制之后。以上结果表明:BmNPV lef-11基因在杆状病毒中非常保守,是一个晚期表达基因,可能不直接参与病毒的起始复制,而是参与病毒的大规模复制过程。     

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。     

家蚕核型多角体病毒基因bm64的表达及定位分析

对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)功能未知基因的研究,有利于全面揭示病毒的复制和感染机制。依据NCBI数据库发表的Bm NPV T3株基因组序列(Gen Bank登录号:L33180.1),选择未知功能基因bm64进行生物信息学分析,该基因ORF全长333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白质分子质量为12.71 k D,等电点4.21。将Bm64蛋白亲水区1~49 aa的编码序列与原核表达载体p GEX-4T-3连接,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta菌株后进行诱导表达。SDS-PAGE检测在预测分子质量处有明显的蛋白质条带,纯化该蛋白质并以此为抗原免疫新西兰大白兔,制备Bm64蛋白多克隆抗体。在病毒感染Bm N细胞后24 h即可用Western blot方法检测到Bm64蛋白的表达。通过间接免疫荧光检测到Bm64蛋白在Bm NPV感染的Bm N细胞中表达,并定位于细胞核。研究结果为进一步分析家蚕核型多角体病毒bm64基因的功能奠定了实验基础。     

Bm59基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制、转录及组装的影响

Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。     

家蚕核型多角体病毒广东分离株Bm126基因编码基序RGD的功能研究

杆状病毒因专一感染昆虫而作为治理农林害虫的生物农药以及作为表达载体在生物医药产业得到广泛应用。前期研究发现家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)中国广东分离株(Bm NPV-GD)的orf126基因(Bm126)包含一个编码精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的基序。采用点突变技术构建RGD编码基序突变的转移载体,利用Bm NPV Bac-to-Bac系统转座获得重组bacmid,通过转染Bm N细胞获得重组病毒,分析突变病毒在感染细胞后期的多角体产量变化,并在病毒感染过程中进一步应用RGD竞争性多肽Cyclo[RGDf-N(Me)V-]分析突变病毒多角体产量的变化,以此探究Bm NPV Bm126编码的RGD基序是否在病毒感染增殖中发挥作用。经t检验统计表明突变病毒感染Bm N细胞后产生的多角体数量与对照病毒没有显著性差异,Cyclo[RGDf-N(Me)V-]处理结果也显示其与对照没有显著差异,表明Bm NPV-GD Bm126基因编码的RGD基序可能不是直接参与病毒感染宿主细胞后的增殖过程,而是辅助病毒的其他因子与宿主细胞互作。     

家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究

对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺(包括前、中、后部丝腺)、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0(ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40)和p GL3(A3-luc-Bm Ser-1 3'UTR-SV40),并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显著减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

miRNA参与调控病毒复制的研究进展

miRNA是1类长度约为22个核苷酸的单链非编码小分子RNA,通过抑制靶基因的转录或降解靶基因mRNA发挥作用。miRNA广泛参与调控细胞生长、凋亡、肿瘤发生以及病毒侵染等过程,通过调控病毒靶基因的表达影响疾病的自然病程和病理、生理过程,已成为研究病毒感染机制的热点。文章综述了miRNA在病毒复制过程中的作用机制研究进展情况,以了解病毒的致病机制,并为miRNA参与调控动物病毒复制的深入研究提供参考。     

家蚕核型多角体病毒Bm90基因缺失对病毒增殖和组装的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpBacmid及Bm90基因补回型病毒Bm90re-polh-egfp-Bacmid,并制备Bm90蛋白的多克隆抗体,研究Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装的影响。将3种重组病毒分别转染Bm N细胞,Western blot检测显示Bm90蛋白在病毒转染Bm N细胞后72 h有表达;但用荧光显微镜观察Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有出现绿色荧光,且检测其病毒滴度为0;用透射电子显微镜观察在Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有子代病毒粒子出现。研究结果表明,Bm90基因缺失会抑制子代病毒粒子的组装和产生,使病毒失去侵染性,Bm90基因是病毒增殖及组装的必需基因。     

人类免疫缺陷病毒HIV结构蛋白Gag在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

人类免疫缺陷病毒(HIV)是导致艾滋病的主要病原之一,HIV病毒的核心结构蛋白Gag有自我装配功能,并能激发体液免疫和细胞免疫,是理想的HIV疫苗靶抗原。将Gag基因克隆至质粒p Bac PAK8中构建重组质粒,并与线性化的家蚕杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,得到重组家蚕杆状病毒Bm NPV-Gag。将该重组病毒感染Bm N细胞和家蚕5龄幼虫,SDS-PAGE、Western blotting检测显示在重组病毒感染的Bm N细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中均有与Gag蛋白大小(55 k D)相符的特异性条带出现,证明重组Gag蛋白成功表达。用ELISA法测定重组病毒感染后不同时间目的蛋白质的表达变化:Bm N细胞中的Gag蛋白含量在感染后的第4天达到最大值6.995 pg/个,在感染第5天后出现下降趋势;5龄幼虫血淋巴中的Gag蛋白含量在感染后的第7天最高,为790.1 ng/m L。重组Gag蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为艾滋病疫苗的研究探索了新的途径。     

家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L(高剂量)、34μg/m L(中剂量)和3.4μg/m L(低剂量)的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

家蚕核型多角体病毒增殖关键基因的鉴定

选择家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)基因组中可能与病毒增殖相关的8个基因dbp、lef-2、lef-3、lef-7、lef-10、lef-11、p143和vp1054作为候选基因,利用家蚕内源性microRNA骨架构建候选基因的干扰载体,并采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对上述候选基因进行干扰试验,筛选病毒增殖的关键基因,以期为开辟家蚕抗Bm NPV研究新路径打下基础。对8个候选基因的RNA干扰试验显示:干扰lef-7对Bm NPV的增殖没有明显影响;对lef-2和lef-11表达的干扰效率最高,达到90%以上,其中干扰lef-11后病毒对细胞的感染率仅为9.16%,远远低于对其他基因干扰后的感染率。依据试验结果初步确认8个病毒增殖相关基因中,lef-11对病毒增殖的影响最大。     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

家蚕二分浓核病毒DNA聚合酶基因启动子P97的研究

家蚕浓核病毒2型(BmDNV-2)已被正式命名为家蚕二分浓核病毒(BmBDV),该病毒致使家蚕罹患浓核病。BmBDV是目前已知唯一能够编码DNA聚合酶的ssDNA病毒,DNA聚合酶的表达对该病毒复制至关重要。使用双荧光素酶报告系统检测BmBDV DNA聚合酶基因启动子P97的活性以及病毒潜在的调控蛋白或宿主的互作蛋白对P97的调控作用。BmBDVDNA聚合酶翻译起始位点上游286 nt序列具有启动子活性,但其活性比病毒非结构蛋白NS1基因启动子P5的活性弱。共转染瞬时表达病毒的NS1蛋白使P97启动子活性降低,而病毒的结构蛋白VP则可提高P97启动子活性;宿主家蚕的转录因子Twist蛋白的表达能够提高P97启动子的活性,但其调控作用较小。     

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。     

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。