猪源多杀性巴氏杆菌的生物学鉴定与荚膜PCR分型

从表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离出13株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),采用Pm种特异性的KMT1-KMT2引物进行PCR扩增,结果与传统的生化反应鉴定完全一致。基于对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,Q_1、Q_3、Q_6、Q_7、Q_(10)、Q_(13)和C_(48-1)鉴定为Pm多杀亚种(Pm subsp.multocida);Q_2、Q_4、Q_5、Q_8、Q_9、Q_(11)、Q_(12)鉴定为Pm败血亚种(Pm subsp.septica)。对13株Pm分离物采用A型、B型和D型引物进行PCR扩增,8株鉴定为A血清型(61.5%);5株鉴定为D血清型(38.5%);没有发现B血清型的菌株。同时对金黄色葡萄球菌抑制试验、中性吖啶黄沉淀试验与荚膜PCR分型的相关性进行了讨论。     

犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

新疆石河子6个规模化奶牛场相继出现出生1～9周龄的犊牛发生体温升高、呼吸困难以肺部感染为主,部分犊牛发生腹泻的疾病,造成90余头犊牛因肺炎死亡.从其中2个发病牛场死亡犊牛采集痛料,经涂片镜检、细菌分离培养、生化鉴定及动物试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm142-x-3、Pm142-x-4、Pm149-xby、Pm149-x,参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtl和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD序列,合成引物,进行PCR扩增.选取Pm149-x-3的目标PCR产物进行序列测定并分析比较,结果表明,Pm149-x-3的kmtl基因片段全长为460 bp,与GenBank中各血清型kmtl基因核苷酸同源性为99.4%;荚膜血清型A菌株特异性基因核苷酸同源性为97%;而扩增其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因均未获得目的条带.由此确认,分离的4株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型.药敏试验表明分离的多杀性巴氏杆菌对氧氟沙星、庆大霉素敏感.     

两株牛源荚膜A群脂多糖3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

用北京、山东两奶牛场疑似牛出败的病死牛组织感染小鼠,小鼠死亡后取组织染色镜检、接种血清TSA和麦康凯培养基,分离到2株疑似多杀性巴氏杆菌,命名为Pm1和Pm2。经细菌培养特性及形态检验、多杀性巴氏杆菌种特异性PCR、荚膜A、B血清群特异性PCR、脂多糖基因分型PCR、荚膜A群透明脂酸抑制试验鉴定其为荚膜血清A群、脂多糖3型多杀性巴氏杆菌。将Pm1和Pm2回归小鼠证明有强毒力。本试验为国内荚膜A群多杀性巴氏杆菌的流行病学研究增添了一些新数据。     

利用菌落多重PCR方法进行不同动物来源多杀性巴氏杆菌鉴定的研究

参照文献报道的多杀性巴氏杆菌种和荚膜型的特异基因合成6对特异引物,建立多杀性巴氏杆菌鉴定的菌落多重PCR方法,结果5株多杀性巴氏杆菌荚膜型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对48株不同动物来源的多杀性巴氏杆菌进行了鉴定和荚膜型分型,同时与间接血凝试验以及Biolog细菌快速鉴定系统进行比对,结果表明,所建立的多重PCR方法与间接血凝试验、Biolog细菌快速鉴定系统的符合率均达到100%。     

牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ.参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因.选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析.结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460 bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%.由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道.     

菌落多重PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌

参照文献报道的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和荚膜生物合成位点hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJf、cbD基因的序列合成了6对特异性引物,建立了多杀性巴氏杆菌种和型的菌落多重PCR方法。结果表明,本所保藏的A、B、D、E、F各型多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Biolog鉴定结果和Carter氏间接血球凝集试验结果相一致;而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌的扩增均为阴性。     

呼伦贝尔市首例羊源荚膜D群多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

为了确定呼伦贝尔市两个羊场的羊只出现体温升高、精神沉郁、食欲废绝、咳嗽、腹泻甚至死亡病因,本研究以病羊病变组织为研究对象,采用常规细菌培养法和多杀性巴氏杆菌种特异性基因KMT1引物以及cap A、cap B、cap D、cap E、cap F荚膜血清型特异性基因引物进行双重PCR扩增,确定分离菌的荚膜血清型,同时应用纸片扩散法对分离菌进行药物敏感性试验。结果显示:从病变的肺组织中分离到1株菌落为灰白色、露珠状、不溶血,革兰氏染色阴性球状短杆菌;通过序列比对及遗传进化树分析,该分离株与印度分离株巴氏杆菌同源性高达100%;本研究只扩增出多杀性巴氏杆菌荚膜血清D群;分离菌株对青霉素、复方新诺明、克林霉素等耐药,对诺氟沙星、卡那霉素、环丙沙星等药物已不敏感。本研究结果表明,我们首次从呼伦贝尔市病羊体内分离到荚膜血清D群多杀性巴氏杆菌。     

不同动物源多杀性巴氏杆菌荚膜分子分型及其致病性研究

为了确定西南民族大学动物医学实验室分离的鸭源、猪源、牛源和山羊源多杀性巴氏杆菌(Pm),即Q1、Z1、N1、Y1株的荚膜血清型及其致病性,试验采用PCR方法对分离的这4株不同动物源多杀性巴氏杆菌的种属和荚膜血清型进行鉴定,对目的基因测序分析,并用Balb/c小鼠对分离菌的致病性进行研究。结果表明:4株菌均为多杀性巴氏杆菌;鸭源Q1株为荚膜血清A型、猪源Z1株和牛源N1株为荚膜血清B型、山羊源Y1株为荚膜血清D型;对目的基因测序后与GenBank上已公布的相应荚膜血清型比对,同源性为98%～100%;不同动物源多杀性巴氏杆菌对Balb/c小鼠的致病性研究显示,猪源荚膜血清B型多杀性巴氏杆菌对Balb/c小鼠有较强的致病力。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定

从病死母猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定、药敏试验、致病性试验和PCR鉴定方法对分离菌株进行鉴定,并用多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物对分离株的荚膜血清型进行鉴定。结果表明:本菌为猪多杀性巴氏杆菌,对多种抗生素高度敏感,对小白鼠有强致病性;PCR扩增16SrDNA基因获得1415bp片段,分离株的16SrDNA核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌(AY078999)的同源性为99%,因此该分离菌株被鉴定为致病性巴氏杆菌,命名为YN20110122株;本菌分离株为荚膜A型血清型多杀性巴氏杆菌。     

水禽4种常见致病菌多重PCR方法的建立及应用

为建立一种能同时检测大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,试验根据大肠杆菌phoA基因、鸭疫里默氏杆菌ompA基因、多杀性巴氏杆菌kmt 1基因、金黄色葡萄球菌FemB基因的保守区域设计4对特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度建立多重PCR方法,检验该方法的特异性、敏感性性、重复性,应用该方法检测145份病死水禽临床样品,并与传统细菌分离鉴定方法进行比较。结果表明：优化后的最佳退火温度为52℃,引物浓度为10μmol/L。建立的多重PCR方法能特异性地扩增出靶基因,沙门氏菌、链球菌、产气荚膜梭菌等临床常见菌均未扩增出条带,对大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌的检出下限是0.4 pg/mL,单一PCR扩增ompA、kmt 1、phoA和FemB基因的检出下限分别为4×10^-3,0.4,4×10^-3,4×10^-6 pg/mL。多重PCR方法对临床样品的检测结果与传统细菌分离鉴定方法的符合率均在90%以上。说明试验建立的多重PCR方法具有结果稳定、重复性高的特...     

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

用PCR方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis，PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)。然后做了药敏试验，并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测，用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenie Pasteurella multocida，T^ Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致；PCR分型表明有46株为D型Pm，18株为A型：Pm，1株为B型Pm，1株无法定型；有8株用PcR检测为T^ Pm；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T^ Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T^ Pm都为D型，都分离于有严重PAR症状的猪。     

牛源多杀性巴氏杆菌血清分型及毒力相关基因的检测研究

为确定新疆北疆部分地区疑似病例中分离的牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）流行的血清型、ST型及毒力相关基因的分布情况,本研究以分离的17株牛源Pm为研究对象,采用荚膜多重PCR分型法、脂多糖多重PCR分型法（LPS-mPCR）、多位点序列分型法（MLST）及PCR方法检测17株Pm分离株的荚膜型、脂多糖型、MLST型及7类共25个毒力相关基因的分布情况。结果显示,13株Pm的荚膜脂多糖型为A：L3型,ST型均为ST1型,4株Pm荚膜脂多糖型为B：L2型,ST型均为ST44;17株Pm毒力相关基因（exbB、exbD、fimA、fur、hgbA、hsf2、nanB、oma87、ompA、ompH、plpB、psl、ptfA、sodA、sodC、tonB和tbpA）的检出率高达100%,toxA基因的检出率为0。结果表明,从新疆北疆部分地区规模化牛场疑似病例中分离的Pm主要血清型为A：L3：ST1型。     

猪圆环病毒2型江苏分离株的遗传进化分析

采用PCR方法扩增了15个猪圆环病毒2型（PCV 2）江苏分离株的基因组DNA,以这些毒株的ORF2核苷酸序列进行遗传进化分析。经序列比较发现,所有分离株均属于2b基因群,其中7株为1A/1B亚群、8株为1C亚群;毒株间核苷酸同源性为93.6%~100%,所编码的Cap蛋白氨基酸同源性为92.3%~100%。PCV 2江苏分离株Cap蛋白的主要变异区域为53~90、121~151和190~210位氨基酸;R59、R89、S90、S121、T134、S169、A190、E210为1A/1B亚群分离株的特征氨基酸,而F8、I53、N68、L89、T90、T121、N134、R169、D210、I215、K234则是1C亚群分离株的特征氨基酸。     

2017年我国猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解2017年我国猪源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）的流行情况及其耐药情况，利用细菌分离培养和PCR方法分离鉴定Pm，对其荚膜血清型、地区分布和感染方式进行调查，并采用纸片法测定分离株对20种抗菌药物的敏感性。结果显示，从全国6288份临床病料中分离并鉴定出236株Pm，总分离率为3.75%。随机选取55株进行血清型分型，其中A型25株，D型27株，F型1株，未定型2株；分离率最高的省份为广东省（4.97%），其次是河南省（3.69%）和湖北省（3.25%）；感染模式中，Pm单纯感染占比42.80%，混合感染占比57.2%，最常与链球菌和副猪嗜血杆菌共感染，比例分别为28.81%和12.29%。耐药性试验显示，Pm对强力霉素的耐药率高达83.64%，对卡那霉素、庆大霉素、链霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物的耐药率为43.64%～52.73%，对多粘菌素B和氧氟沙星最敏感（耐药率均为1.82%）。本研究表明我国猪群中Pm流行的主要血清型仍然是A型和D型，临床上Pm与其他细菌发生混合感染的情况普遍存在，并且对多种抗生素产生了耐药性。     

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及oppA基因遗传进化分析

【目的】了解福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）的流行及oppA基因遗传进化情况。【方法】本研究采用细菌分离培养、生化试验、16S rRNA PCR扩增测序、PCR荚膜分型、oppA基因克隆及相似性分析、动物回归试验等方法对分离菌株进行鉴定和分析。【结果】本研究共分离到10株菌,分离菌在血平板上形成淡灰白色、湿润光滑、奶油露珠状菌落;分离菌株能酵解蔗糖、果糖、麦芽糖和甘露醇,不能分解葡萄糖、枸橼酸盐、乳糖、硫化氢等,与多杀性巴氏杆菌生化特性基本一致;分离菌株16S rRNA序列与GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌相似性达99.9%以上,10株分离菌均为多杀性巴氏杆菌;PCR荚膜分型显示,6株分离菌为荚膜A型,4株为荚膜D型;基于oppA基因的遗传进化树显示,10株分离菌均位于同一分支内;动物回归试验结果显示,在24 h内攻毒小鼠死亡率较高（21/30）,分离菌有较强的致病力。【结论】福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌流行菌株的荚膜血清型主要是A和D型,且大部分菌株都来源于共同的祖先,本研究结果丰富了猪多杀性巴氏杆菌的流行病学资料,并为该病的防控奠定基础。     

Isolation,Identification and Genotyping of Pasteurella multocida from Fowl Cholera

In order to determine the suspected avian cholera pathogen and geneotypes, bacteria isolation technology was used to isolate and culture pathogenic bacteria, the isolated bacteria were identified by traditional methods and molecular biological methods. Geneotyping of the isolated bacteria were determined using PCR technology and gene sequence analysis. The results demonstrated that the isolated bacteria had typical culture characteristics of Pasteurella multocida (Pm),and the morphology of the colony, the characteristics of cell staining, the physiological and biochemical characteristics were consist with Pm; 457 bp fragment was amplified by PCR. Geneotyping results showed that only A primer amplified the target gene fragment of 1 050 bp, sequence analysis also showed that the isolated bacteria shared 97.6% to 100.0% sequence homology with reference strains, and phylogenetic tree analysis showed that the isolated bacteria and A type Pm were in a branch.The experimental results indicated that the isolated bacteria was identified as capsular serotype A of Pm, the results provided reference for the prevention and control of fowl cholera.     

禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定及基因分型

为确定疑似禽霍乱病例病原种类及其病原基因型,本研究采用细菌分离技术对病原菌进行实验室分离培养,应用传统方法和分子生物学方法对分离细菌进行鉴定,并应用PCR扩增和基因序列分析对分离细菌进行基因分型。结果显示,分离菌具有多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）典型培养特征,菌落形态和菌体染色特征、生理生化特性均与多杀性巴氏杆菌相符;PCR扩增到457 bp的基因片段。采用5对分型引物对分离菌进行基因分型显示,仅有A型引物扩增到大小1 050 bp的目的基因片段,序列分析也显示分离菌荚膜基因与A型多杀性巴氏杆菌参考菌株荚膜特异性基因同源性高达97.6%~100.0%,系统进化与A型多杀性巴氏杆菌处于同一进化分支。结果表明,疑似禽霍乱病例病原为A型多杀性巴氏杆菌,本研究结果将为禽霍乱的防控提供参考资料。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.