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应用特异引物和简并引物检测百合斑驳病毒 总被引:4,自引:0,他引:4
应用特异引物和简并引物对百合斑驳病毒(LMoV)进行RT-PCR检测.结果表明,特异引物和简并引物均能从LMoV感病百合组织中扩增出与预期大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物,简并引物还能从感染TBV的郁金香病叶中扩增出目标片段.将感染LMoV组织总RNA以10倍梯度稀释成不同浓度检测,特异引物检测的灵敏度为10-4,简并引物的灵敏度为10-3.对特异引物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析表明与LMoV不同分离物的序列同源性为90%~99%,说明采用本研究确定的方法检测百合斑驳病毒结果准确可靠. 相似文献
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半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究 总被引:7,自引:0,他引:7
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3%~52%的产量损失并使大豆品质降低,目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测,本文建立了半巢式RT-PCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA,并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物,经第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增,分别得到275 bp和196 bp大小的特异性基因片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91%~95%的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这2种方法高出103倍以上。 相似文献
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百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用 总被引:1,自引:0,他引:1
为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。 相似文献
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采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,CI)基因的3′端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-CI200。经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体。Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应。用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%。研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,Cl)基因的3'端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上.构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CL200.重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-C1200.经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体.Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应.用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%.研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础. 相似文献
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RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。 相似文献
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玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究 总被引:2,自引:0,他引:2
玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国对外公布的检疫性有害生物。本研究根据该病毒外壳蛋白基因的保守序列,设计得到特异性引物及Taqman荧光探针,建立了MCMV的实时荧光RT-PCR方法,并对其灵敏度与特异性进行了研究。该方法针对2个不同来源的毒株均能得到典型扩增曲线,而没有从小麦线条花叶病毒、玉米粗缩病毒和玉米矮花叶病毒的RNA得到扩增曲线,表明引物与荧光探针具有良好的特异性。针对玉米褪绿斑驳病毒RNA不同稀释度样品,实时荧光RT-PCR检测低限达到10-5稀释度,检测灵敏度要比普通RT-PCR高出100倍。因此,本研究建立的MCMV实时荧光方法具有特异性强、灵敏度高和快速有效的优点。 相似文献
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大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus(BSMV)是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(coat protein, CP)基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus(SBMV)、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus(WSMV)、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus(MCMV)、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus(TRSV)、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus(BPMV)和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus(ToRSV)6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。 相似文献
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对一株进境隔离种植中疑似病毒症状的荷兰百合进行检测、鉴定。采用RT-PCR方法对疑似样品的部分基因序列进行扩增、测序,比对后,建立系统发育树进行亲缘关系分析。结果表明,采用香石竹潜隐病毒属和马铃薯X病毒属(CarlapCar1I/M4T和Potex 5/Potex 1RC)简并引物均可扩增到预期大小的片段(1 257 nts和737 nts)。序列分析显示,扩增片段与车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,Pl AMV)3'端序列(包含TGBp2、TGBp1、CP,3’-NTS)和部分依赖于RNA的RNA聚合酶基因序列一致性可达79.9%~99.5%和80.5%~99.3%。利用PlAMV的特异性引物(PlAMV-cpup/PlAMV-cpdw)进行检测,结果进一步证实该百合样品含有PlAMV。通过建立系统发育树得出,该病毒分离物与来自荷兰的PlAMV百合分离物优先聚为一簇,表明二者的亲缘关系最近。这是我国口岸首次截获车前草花叶病毒的报道。 相似文献
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我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。 相似文献
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齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究 总被引:2,自引:0,他引:2
齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CyMV)是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明:普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100%的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。 相似文献
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应用聚合酶链反应检测蓝舌病病毒的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
聚合酶链反应是体外扩增特异性DNA系列的一种有效方法。本研究以第10型蓝舌病病毒群特异性病毒抗原VP_7的编码基因S_7为模板,用禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶将模板RNA反转录成cDNA,再应用聚合酶链反应对其进行扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测,证明扩增物的大小与设计相符,将扩增物制备成探针后与第10型蓝舌病病毒核酸进行杂交,证明扩增物为病毒特异性核酸,同时设立的细胞核酸和鹿流行性出血病病毒核酸的扩增结果为阴性。本研究中所使用的引物还可用来扩增第1、11、13、15、17等型的蓝舌病病毒和一株分离的蓝舌病病毒以及直接扩增出动物血液内的蓝舌病病毒。 相似文献
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