兔TLR2 TLR4部分cDNA克隆及其在组织中的分布

从日本大耳白兔的脾脏组织克隆出Toll样受体基因2(RTLR2)和Toll样受体基因4(RTLR4),并对其在兔的17种组织中的表达分布进行了检测。RTLR2和RTLR4核苷酸序列与GenBank中登载的穴兔(Oryctolagus cuniculus)TLR2序列(NM_001082781)、TLR4序列(NM_001082781)的相似性分别为99%和100%;推导氨基酸序列的同源性比对发现,与人、马、野猪、猫、猩猩、牛、绵羊和鼠等8种动物相比,RTLR2与马的同源性最高,为80%,与鼠最低,为61%,而RTLR4与这几种动物的同源性在62%~75%之间;兔的胸腺、盲肠、睾丸等15种组织中均检测到TLR2和TLR4 mRNA的转录产物,但骨骼中未发现TLR2和TLR4,TLR4在皮肤中也未见表达。     

兔TLR2、TLR3和TLR4部分cDNA序列的克隆及分析

用RT-PCR技术从日本大耳白兔脾脏组织克隆出兔Toll样受体2、3、4基因（拟命名为RTLR2、R TLR3和RTLR4）的cDNA序列并进行测序,获得的3个Toll样受体基因序列长分别为128、150和139bp,并将其测序结果与GenBank中登录的穴兔（Oryctolagus cuniculus）的Toils核苷酸序列进行比对,发现本次克隆到的RTLR2与穴兔TLR2的基因序列（NM_001082781）相似性为99％,而RTLR3与TLR3（NM_001082219）和RTLR4与TLR4（NM_001082732）相似性均为100％。Protein Blast同源性结果显示,RTLR2、RTLR3和RTLR4的氨基酸序列与穴兔TLR2、TLR3和TLR4的同源性皆为100％,与马、人、野猪等其他8种动物TLRs的比较,与RTLR2同源性最高的是马的80％,其他的只有61％～78％;与RTLR3同源性最高是马和野猪的97％,其他也较高达93％～95％;而RTLR4与其他8种动物的同源性均较低75％以下。结果表明：RTLR2、RTLR3和RTLR4分别为免TLR2、TLR3和TLR4的部分cDNA基因序列;TLRs在不同物种的进化过程中存在种属特异性。     

鸭髓样分化因子MyD88部分cDNA克隆及组织表达图谱分析

本试验采用RT-PCR技术克隆出鸭MyD88部分cDNA序列,克隆到的序列长为195 bp;同源性分析结果显示,鸭MyD88与鸡、火鸡、珍珠鸟的同源性最高,为97％～100％;与人、鼠、牛、猪、狗、马、兔、鲤鱼的同源性为83％～84％;与绵羊的同源性为79％;系统进化树分析表明,鸭MyD88与鸡的亲缘关系最近,与火鸡、珍珠鸟的较为接近,与狗、鼠、兔、人、猪、马、绵羊、牛的亲缘关系依次渐远,与鲤鱼的亲缘关系最远.检测MyD88在鸭7种组织中的分布情况,结果表明,在鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、腔上囊中均检测出MyD88 mRNA的转录产物,而在肾脏、脑中未见.提示MyD88在不同种属及不同组织中具有生物多样性.     

羊驼催乳素受体基因(PRLR)exon10的克隆与序列分析

通过氰仿／异戊醇法从羊驼血液和组织中提取羊驼基因组DNA，首次扩增出羊驼PRLR基因（Prolactin Receptor，PRLR）exon10序列（GenBank登录号为DQ206831），并与其它动物相应区域作了同源性比较，结果表明：羊驼PRLR基因exon10的开放阅读框为1133bp，包括1046bp的编码区和87bp的拖尾区；同源性比较显示，羊驼PRLR基因exon10的核苷酸序列与哺乳动物（牛、绵羊、猪、狗、兔、大鼠等）的同源性较高，达80％，氨基酸序列的同源性则≥66％，而与鱼类的同源性则较低，仅为40％～45％。     

猪Toll样受体7 cDNA的克隆及序列分析

本研究应用RT—PCR和RACE技术从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体7（Toll—likere—ceptor7,TLR7）的cDNA序列。分析结果表明,克隆到的序列全长3834bp（GenBank登录号：EF469730）,其3150bp的开放阅读框编码1050个氨基酸残基的猪Toll样受体7蛋白。推导的氨基酸序列分析显示,在猪TLR7的胞外区,具有LRR-RI结构域,胞内具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征,同源性分析结果显示,TLR7在进化过程中具有高度保守性,与牛、狗、人、猫和小鼠的氨基酸序列同源性分别为90．8％、87．4％、84．9％、86．7％和78．2％。     

应用PCR等核酸技术检测动物饲料中牛羊组织成分

为准确鉴别不同品种动物源性饲料，防范疯牛病及羊痒病的传播，建立了检测牛、绵羊和山羊组织种间特异的合酶链反应（PCR）；用Mbo I、Vsp I、Rsa I分别对从动物饲料中检测得到的牛、绵羊和山羊组织的PCR产物进行酶切分析、酶切图谱与序列结构相符；核酸测序结果表明，3种动物组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合。用3种检测方法检测牛、绵羊和山羊组织无交叉反应，检测猪、鸡、兔和鱼等动物组织均呈阴性。PCR检测的敏感性可达0．25％（质量分数），PCR检测全过程包括样品处理，可在3h内完成。     

绵羊DECR1基因exon 5部分序列多态性分

试验根据GenBank登录的牛2,4-双烯-CoA还原酶1（2,4-dienoyl-CoA reductase1,DECR1）基因序列（NP_001068891）设计引物,应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基因的exon 5部分序列进行克隆测序;利用PCR-SSCP技术检测了3个绵羊群体exon 5单链构象多态性（SNP）,所获序列与GenBank中其他物种exon 5序列进行了同源性比较,并构建了亲缘关系聚类分析图。结果表明,绵羊DECR1基因exon 5长为137 bp,3个绵羊群体中exon 5均不存在SNPs,各种动物之间DECR1基因exon 5的同源性较高,在81.02%（鸡）～97.08%（牛）之间,其中绵羊和牛同源性最高,达到97.08%;与鸡的同源性最低,为81.02%;聚类分析结果显示,绵羊首先与牛聚为一类,再分别与兔子、狗聚为一类,最后分别与人、猪聚为一类,绵羊与牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远,与传统分类相一致,说明DECR1基因exon 5在动物进化过程中高度保守。     

西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析

为了研究不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因，利用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊泌乳60d乳腺组织及泌乳28d乳腺组织中差异表达基因文库，用Real-Time PCR技术验证阳性克隆血清淀粉样蛋白A3（SAA3）基因，通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织SAA3，并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库，筛选克隆了乳腺组织SAA3基因，GenBank登录号为：DQ839400，编码区长度为396bp，含有131个氨基酸。西农萨能羊乳腺组织中SAA3与牛（GenBank：NM_181016）、兔（GenBank：M64696．1）、人（GenBank：BC020795）、鼠（GenBank：NM_011315）核苷酸同源性分别为95％、84．3％、81.3％和81.9％，氨基酸同源性为93％、76％、72％、72％；在编码区261-287位较人、兔、鼠SAA编码区多27个碱基，连续大于5个氨基酸的保守区域有6个，较人SAA多3个潜在功能基序。     

鸭Toll样受体3基因克隆及序列分析

为研究鸭Toll样受体3(TLR3)的结构及功能,根据GenBank中已公布的番鸭TLR3(JQ910167.1)基因设计引物,采用RT-PCR从北京鸭外周血单个核细胞中克隆出北京鸭TLR3,命名为duTLR3。利用生物信息学技术预测其结构及功能,研究表明,duTLR3基因开放阅读框为2 688bp,编码895个氨基酸,富含17.0%亮氨酸;该分子属于Ⅰ型跨膜受体,由胞外区(1-695aa)、跨膜区(696-718aa)和胞内区(719-895aa)3部分组成,N端含有一个信号肽序列,胞外富含18个亮氨酸重复序列(LRR),胞内含有Toll/IL-1R同源区结构域。核苷酸序列同源性分析显示,duTLR3与金定鸭TLR3亲缘关系最接近达到99.6%;与番鸭、鹅、原鸡、斑胸草雀的亲缘关系次之,并同属于禽类分支上;与番鸭、鹅、原鸡、斑胸草雀、人、猕猴、狒狒、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、猫亲缘关系渐远;与草鱼和鲤鱼亲缘关系最远。北京鸭体内组织分布结果显示,duTLR3为组成性表达。本研究成功克隆了北京鸭TLR3基因,预测分析并证实了duTLR3具有典型的TLR家族结构特征,为后期探究TLR3如何识别病毒的RNA及引起下游信号级联反应奠定了基础。     

鸡β-防御素-3的克隆与诱导表达

利用反转录PCR（RT—PCR）与套式PCR技术检测Gal-3基因在鸡体不同组织的分布表达。实验结果表明Gal-3基因在法氏囊、皮肤、舌头、肺脏、骨髓、气管等组织中广泛分布，在肾脏、脾脏、肝脏、胰脏等组织中没有检测到。对从鸡骨髓中扩增出来的β-防御素（Gal-3）cDNA进行克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为297bp，与GenBank中的Gal-3cDNA序列完全相同。核苷酸序列比较表明在同源性上，Gal-3与Gal-1、Gal-2基因核苷酸相似性分别为75％、50％，同火鸡GPV-1基因同源性最高，达9l％。体外诱导表达实验表明在气管上皮细胞中LPS与灭活卡介苗可以诱导Gal-3的表达；Gal-3在法氏囊细胞、肺上皮细胞的表达为持续性表达。     

北极狐多巴胺受体D1基因的克隆测序

为了获得北极狐多巴胺受体D1基因序列,给北极狐自咬行为提供理论依据。采用聚合酶链式反应方法,从北极狐耳组织扩增出多巴胺受体D1基因的部分外显子序列,并对其进行克隆测序,将该序列提交到Genebank上。Genebank中的Blast分析表明,北极狐多巴胺D1受体基因与家狗(Canis familiaris)的同源性为99%,与牛(Bos taurus)的同源性为93%,与人(Homo sapiens)的同源性为92%。     

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。     

水牛LPIN1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆获得水牛脂素1（LPIN1）基因，并对其进行生物信息学分析，为揭示该基因在水牛脂肪沉积、生殖发育和泌乳调控中的作用奠定基础。本研究以水牛卵巢组织cDNA为模板，PCR扩增获得了LPIN1基因CDS区全长后测序，并结合生物信息学分析方法预测及分析蛋白质理化性质、二级结构及三级结构等。结果表明，水牛LPIN1基因编码区长2 793 bp，编码930个氨基酸。MegAlign软件分析显示，水牛LPIN1基因核苷酸序列与水牛（预测）、牦牛、黄牛、山羊、藏羚羊、绵羊、猪、骆驼、人和小鼠LPIN1基因的同源性分别为99.6%、97.9%、97.7%、97.5%、97.4%、97.1%、89.9%、89.8%、86.2%和83.5%；水牛lipin1蛋白氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、藏羚羊、骆驼、猪及人的同源性分别为99%、99%、99%、99%、94%、94%及90%。应用Mega 5.0软件构建系统进化树发现，水牛与黄牛的亲缘关系最近，其次为绵羊和山羊，LPIN1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。对lipin1蛋白分析发现，其二级结构由α-螺旋、β-折叠、T-转角和无规则卷曲组成；蛋白呈弱酸性，无信号肽，亚细胞主要定位于细胞核中，存在Lipin_N、LNS2和AF1Q等结构域，其中Lipin_N、LNS2为保守结构域。     

牛FoxO1基因的cDNA克隆及在新生犊牛组织中的表达分析

根据GenBank已发表的人、小鼠、猪FoxO1基因的mRNA序列设计引物克隆了牛FoxO1基因的cDNA序列,同时采用实时荧光定量PCR方法分析FoxO1在新生犊牛16个组织中的表达情况。结果表明:牛FoxO1基因与人、黑猩猩、小鼠、大鼠、猪的同源性分别为88%、88%、86%、85%和89%,FoxO1基因在新生犊牛各个组织中均有表达,但在不同组织中的表达量有差异,在腹内脂肪、小肠淋巴结、肺、脾、胸腺中表达量较高,其次在胃、肾、肝、心、小肠、半腱肌、背最长肌,在脑、胰腺、比目鱼肌、腓肠肌等组织中表达量较低,这可能与FoxO1基因在有机体各组织器官中的生物学效应有关。     

猪甲状腺激素应答spot14基因的克隆及组织表达研究

基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,成功克隆了猪甲状腺激素应答spot14(thyroid hormone responsive spot14, THRSP)基因(GenBank登录号:JF_951726),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了THRSP基因的组织分布规律。结果发现,克隆的猪THRSP基因长为621 bp,包括一个完整的开放阅读框架453 bp,编码150个氨基酸。克隆的猪THRSP基因与人、牛、小鼠、褐鼠、欧洲兔、鸡的核苷酸序列同源性分别为83.8%、88.5%、80.9%、80.7%、85.1%、47.1%;推导的cDNA编码区(CDs)的氨基酸序列与人、牛、小鼠、褐鼠、欧洲兔、鸡的同源性分别为76.9%、80.8%、76.2%、76.2%、82.1%、32.0%,构建的系统发育树显示猪与牛的亲缘关系最近。组织表达分析结果表明,THRSP基因在肝脏和脂肪组织中高表达,在脑、脾脏、胃、皮肤、盲肠、直肠中表达量相对较低,在肺脏、十二指肠、空肠、回肠中微量表达,在肾脏、肌肉中无表达。THRSP基因在肝脏、脂肪等脂肪生成组织的高表达暗示了其可能作为调节脂肪合成代谢的调控因子参与脂肪合成,但其调控机理有待进一步研究。     

Cloning and Sequence Analysis of Buffalo Keap1 Gene and Investigation of Its Expression Pattern in Different Tissues

In this study,the CDS sequence of buffalo Keap1 gene was cloned and analyzed,then its expression pattern in different tissues was also investigated.A pair of primers of buffalo Keap1 gene was designed based on the nucleotide sequence of Bos taurus Keap1 gene from GenBank,and then the buffalo Keap1 gene was amplified.Using the bioinformation techniques,the gene sequence and the protein structure were analyzed.The expression level of Keap1 gene in different tissues were detected with Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of buffalo Keap1 gene coding sequence was 1 875 bp and encoded 624 amino acids.The multiple sequence alignment results showed that buffalo Keap1 gene shared 99%,96%,92% and 90% of similar nucleotide sequence with that of Bos taurus,Ovis aries,Sus scrofa and Homo sapiens,respectively.And the phyogenetic tree also showed the conservatism between several different species.The second structure of buffalo Keap1 protein was predicted as 24 alpha regions,40 beta regions,38 turn regions and 27 coil regions.In addition,the results of Real-time quantitative PCR showed that Keap1 mRNA exists in all seven tissues,but the most abundant expression was in heart and the minimal expression was in liver and spleen.The results provided an foundation for further study of Keap1-Nrf2-ARE signal pathway,for enhancing the ability of antioxidant of buffalo embryo in vitro culture.     

新西兰白兔MSTN基因克隆、生物信息学分析及表达谱构建

肌肉生长抑制素（MSTN）是骨骼肌发育的主要调控因子，为获得新西兰白兔MSTN基因序列及其表达规律，试验通过RT-PCR技术从新西兰白兔腿肌组织中扩增并克隆得到MSTN基因序列，利用在线网站对其进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在新西兰白兔同一时期不同组织及不同时期腿肌组织中的表达量。结果显示，新西兰白兔MSTN基因CDS区序列长1 128 bp，编码375个氨基酸，其核苷酸序列与GenBank上公布的人、猪、马、小鼠、犬、牛和鸡的核苷酸序列相似性分别为95.9%、94.9%、94.9%、91.7%、91.5%、91.3%及84.2%。新西兰白兔MSTN蛋白属于酸性、亲水性分泌蛋白，且具有不稳定性，不含跨膜结构，含有1个信号肽，主要分布在内质网和线粒体中。MSTN蛋白二级结构和三级结构预测结果一致，以无规则卷曲为主，其次是α-螺旋、延伸链，为混合型蛋白。蛋白质互作关系预测发现，MSTN蛋白与PAX7、MYOG、IGF1、FST、Smad3及Smad2等与肌肉生长发育有关的蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析结果表明，新西兰白兔MSTN基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腿肌、子宫和胃中均有表达，在腿肌中表达量最高，极显著高于其他组织（P<0.01），其次是肾脏，在肝脏中的表达量最低。不同时期腿肌组织中的表达量分析结果显示，新西兰白兔MSTN基因在180日龄腿肌组织中的表达量显著高于90和240日龄（P<0.05）。研究结果为深入探讨MSTN基因对家兔肌肉生长发育的调控机制奠定了基础。     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。