多浪羊PROKR2基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

【目的】克隆多浪羊促动力素受体2(prokineticin receptor 2,PROKR2)基因,并检测初情期启动过程中PROKR2基因在多浪羊不同组织中的表达水平,为探究PROKR2基因在绵羊初情期启动过程中的作用提供依据。【方法】以初情期后多浪羊下丘脑cDNA为模板,PCR扩增PROKR2基因并克隆测序。利用DNAMAN软件对测序结果进行拼接,采用MegAlign软件进行物种间相似性比对并构建系统进化树,并利用生物信息学软件预测多浪羊PROKR2蛋白理化性质和结构功能。使用实时荧光定量PCR技术检测PROKR2基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管及子宫中初情期前、初情期及初情期后的表达水平。【结果】克隆获得PROKR2基因序列大小为2 641 bp,包括5′-UTR 143 bp、3′-UTR 1 343 bp和CDS区1 155 bp,编码384个氨基酸,与GenBank中绵羊预测mRNA序列(登录号：XM＿004014342.5)相似性为99.83%。系统进化树表明,多浪羊PROKR2基因的遗传距离与山羊最近,与鸡最远。生物信息学分析表明,PROKR2蛋白为疏水稳定碱性蛋...     

多浪羊NPTX1基因克隆、生物信息学分析及在初情期的表达研究

【目的】试验旨在克隆多浪羊神经元正五聚体蛋白1(neuronal pentraxin 1,NPTX1)基因CDS序列,利用生物信息学分析NPTX1蛋白的结构和功能,并研究其在多浪羊初情期启动过程中性腺轴不同组织中的表达规律。【方法】采集初情期前、初情期、初情期后健康雌性多浪羊的下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫组织,提取总RNA并反转录成cDNA,以初情期前下丘脑cDNA为模板,PCR扩增多浪羊NPTX1基因并克隆测序,对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析NPTX1基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管5个组织中的表达水平。【结果】克隆得到NPTX1基因长1 576 bp,其中CDS区序列为1 299 bp,与GenBank上预测的绵羊mRNA序列(登录号：XM＿005683183.3)相似性达99.85%。系统进化树分析得出,多浪羊NPTX1基因与绵羊的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析发现,NPTX1蛋白为不稳定的亲水性酸性蛋白,具有1个信号肽,属于分泌蛋白;二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比分别为41.90%和40.73%,与三级结构预测结果一致。...     

多浪羊BMP7基因克隆、生物信息学分析及其在不同初情期阶段组织表达分析

【目的】对多浪羊骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP7)基因序列进行克隆和生物信息学分析,并检测多浪羊在初情期3个阶段5个组织中的表达规律,为探究BMP7基因在多浪羊初情期中的生物学功能提供参考。【方法】采用PCR扩增多浪羊BMP7基因序列并克隆测序,利用Mega 7.0软件构建系统发育树,利用生物信息学软件分析BMP7蛋白的理化性质和结构功能;采用实时荧光定量PCR检测BMP7基因在初情期前、初情期、初情期后多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫5个组织中的表达量。【结果】试验成功获得多浪羊BMP7基因序列长1 334 bp,其中编码区长1 296 bp,编码431个氨基酸,与绵羊和牛的亲缘关系最近,其次是人、猴、马,与小鼠和犬的亲缘关系最远。生物信息学分析显示,BMP7蛋白分子式为C₂₂₀₀H₃₃₇₄N₆₃₂O₆₂₈S₁₇,理论等电点(pI)为8.17,原子总数为6 851个,不稳定指数为53.18,脂溶性系数76.96,总平...     

Lin28B基因表达与绵羊初情期启动的关系研究

初情期是家畜从不能繁殖到获得繁殖能力的标志,是雌性动物发育过程中的一个关键阶段。研究以性早熟的多浪羊和性晚熟的和田羊为研究对象,对其Lin28B基因外显子3进行克隆,采用Real-time PCR技术分析Lin28B基因在多浪羊和和田羊幼年期、初情期下丘脑、卵巢中表达变化,结果显示多浪羊和和田羊Lin28B基因外显子3序列相同,多浪羊下丘脑和卵巢中Lin28B基因mRNA表达量在初情期时低于幼年期(P0.05);和田羊卵巢Lin28B基因mRNA表达量在初情期时低于幼年期(P0.05)。研究结果表明,Lin28B基因表达下调与初情期启动呈正相关,该研究对于揭示Lin28B基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。     

多浪羊GnRHR基因克隆、初情期组织表达研究及生物信息学分析

本研究旨在克隆多浪羊GnRHR(Gonadotropin Releasing Hormone Receptor,GnRHR)基因编码区，并用得到的CDS序列进行生物信息学分析，同时测定与繁殖相关组织中GnRHR基因的表达情况。利用RT-PCR和TA克隆的方法获得多浪羊GnRHR基因的编码区域，采用实时荧光定量PCR方法检测GnRHR基因在多浪羊初情期前、初情期和初情期后下丘脑、垂体、子宫、卵巢和输卵管5种组织的表达情况。本研究成功克隆获得多浪羊GnRHR基因编码区域。多浪羊GnRHR基因CDS序列长987 bp，编码328个氨基酸，与绵羊的同源性最高；对该序列进行生物信息学分析显示该蛋白分子式为C₁₇₆₂H₂₆₉₆N₄₃₂O₄₄₆S₂₀；理论等电点(pI)为9.39；不稳定指数为32.51，为稳定疏水性蛋白；具有7个跨膜区域；二级结构主要为α-螺旋及无规则卷曲。荧光定量PCR检测到多浪羊GnRHR基因在初情期及初情期前后3个时期5种组织均有表达，垂体和卵巢高表达；初情期时垂体相...     

多浪羊Lin28A基因克隆及其在初情期启动过程中的表达研究

旨在克隆绵羊Lin28A基因cDNA序列,探讨其在初情期启动过程中的表达规律和调控特性。本研究分别在初情期前(第1次发情前1周)、初情期、初情期后(第1次发情后1周)屠宰多浪羊各5只。采集下丘脑、垂体、卵巢组织,对其Lin28A基因cDNA进行克隆,利用DNAman 6.0软件对多浪羊Lin28A氨基酸与其他物种的Lin28A氨基酸序列进行同源性比较。采用Real-time PCR技术分析下丘脑、垂体、卵巢中Lin28A基因、let-7a、let-7b在初情期启动过程中表达的变化规律。结果表明,多浪羊Lin28AcDNA序列为3 581bp,包括2 963bp的3′UTR和618bp CDS;多浪羊Lin28A氨基酸与人、家鼠、牛和绵羊的同源性分别是87.56%、88.52%、92.68%和89.95%,与鸡、斑马鱼的同源性分别是76.10%、61.84%。在初情期前至初情期的过程中,下丘脑、卵巢中Lin28A表达显著降低(P<0.05),let-7a、let-7b的表达没有显著变化(P>0.05)。本研究结果对于揭示Lin28A基因在绵羊初情期启动中的作用及机制提供了科学依据。     

波尔山羊PLAG1基因克隆、多态性鉴定及其与出生体重、体尺性状的关联分析

【目的】 试验旨在研究多形性腺瘤基因1（plemorphic adenoma gene 1,PLAG1）基因序列特征、多态性以及对山羊出生体重、体尺的影响。【方法】 以波尔山羊为研究对象,克隆PLAG1基因序列并测序,采用实时荧光定量PCR鉴定其在不同年龄和体重波尔山羊组织中的表达模式,采用Western blotting方法检测PLAG1在不同体重羔羊腿肌中的表达水平,进一步筛选PLAG1基因CDS和3'-UTR区SNP,并分析各位点不同基因型与波尔山羊出生体重、体尺的相关性。【结果】 波尔山羊PLAG1基因CDS全长1 500 bp,编码499个氨基酸,PLAG1蛋白相对保守。组织表达谱显示,PLAG1基因在出生体重较大的羔羊心脏、小肠和腿肌中表达水平显著或极显著高于出生体重较小的羔羊,在胎羊各组织中mRNA表达水平均显著或极显著高于成年母羊（P<0.05;P<0.01）;PLAG1蛋白在出生体重较大的羔羊腿肌中表达量极显著高于出生体重较小的羔羊（P<0.01）。在波尔山羊PLAG1基因3'-UTR区共筛选到6个SNPs位点,分别为：2664 A>G、2712 A>G、2721 T>C、2879 T>A、2990 A>T和3270 A>G。关联分析发现,2664 A>G位点AG基因型个体出生管围显著大于GG基因型（P<0.05）;2721 T>C位点TT基因型个体出生体长显著大于TC基因型（P<0.05）;2879 T>A位点TA基因型个体出生管围显著大于AA基因型（P<0.05）;2990 A>T位点AA基因型个体出生体重显著高于AT基因型（P<0.05）;3270 A>G位点GG基因型个体出生体长显著大于AA基因型,AG基因型个体出生胸围显著大于AA基因型（P<0.05）。【结论】 PLAG1基因在波尔山羊胎羊各组织中表达水平均高于成年母羊,发育早期的表达水平与出生羔羊体重相关。PLAG1基因可作为分子标记用于波尔山羊早期生长选育。     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。     

绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。     

策勒黑羊ERα基因克隆、生物信息学分析及卵巢组织表达研究

【目的】 克隆策勒黑羊雌激素受体α(estrogen receptor α,ERα)序列并进行生物信息学分析,同时测定策勒黑羊卵巢中ERα基因的表达情况。【方法】 利用RT-PCR和TA克隆方法获得策勒黑羊ERα基因序列,并采用在线软件对其进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法检测ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黄体期和妊娠30 d母羊卵巢中的表达情况。【结果】 成功克隆获得策勒黑羊ERα基因序列,长1 791 bp,编码596个氨基酸,与山羊和牛的相似性最高。生物信息学分析显示,ERα蛋白分子式为C₂₉₃₀H₄₆₀₀N₈₂₂O₈₆₂S₄₁,理论等电点(pI)为7.32,不稳定指数为50.33,为不稳定亲水性蛋白;存在28个O-糖基化位点和54个磷酸化位点,不存在N-糖基化位点;主要定位在细胞核中,不具备跨膜结构;二级结构主要为α-螺旋及无规则卷曲。实时荧光定量PCR检测显示,ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黄体期和妊娠30 d的卵巢中均有表达,与卵泡期相比,黄体期ERα基因表达量极显著下降(P<0.01),妊娠30 d ERα基因表达量极显著升高(P<0.01)。【结论】 策勒黑羊ERα基因序列长1 791 bp,编码596个氨基酸,为亲水蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黄体期和妊娠30 d的卵巢中均有表达。本研究结果为进一步探究ERα基因在策勒黑羊卵巢卵泡发育、黄体形成和妊娠中发挥的作用提供参考。     

藏羊MSTN基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对藏羊肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因进行克隆和生物信息学分析，检测其在藏羊不同组织中的表达，为探究MSTN基因在藏羊中的生物学功能提供参考。【方法】 以藏羊背最长肌组织cDNA为模板，克隆藏羊MSTN基因完整CDS区序列并测序，用SeqMan程序对测序结果进行拼接，并用BLAST在线程序对组装后的序列进行分析鉴定。用生物信息学软件进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析，用实时荧光定量PCR检测MSTN基因在藏羊不同组织中的表达量。【结果】 藏羊MSTN基因CDS全长为1 128 bp，编码375个氨基酸。藏羊MSTN基因氨基酸序列与绵羊、牦牛、牛、猪、恒河猴、人、黑猩猩、犬、鸡及斑马的相似性依次为100.0%、93.4%、93.4%、95.2%、94.4%、94.2%、94.4%、93.1%、87.8%和87.5%；系统进化树分析结果表明，藏羊与绵羊的亲缘关系最近，与斑马和鸡的亲缘关系最远。藏羊MSTN蛋白属于亲水性分泌蛋白，且具有不稳定性，不含跨膜结构，含1个信号肽，存在31个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化修饰位点，主要分布在线粒体和细胞质中；MSTN蛋白二级结构以无规卷曲为主，其次是α-螺旋、延伸链和β-转角；三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示，MSTN基因在藏羊不同组织中均有表达，其中在臂三头肌和半腱肌的表达量显著高于肺脏、下丘脑、心脏、肝脏、十二指肠、瘤胃和肾脏（P<0.05）。【结论】 成功克隆了藏羊MSTN基因；该基因在藏羊肌肉中的表达量高于内脏组织。该结果为进一步研究MSTN基因对藏羊肌肉生长发育的调控机制奠定了基础。     

绵羊MyoG基因内含子Ⅱ多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】 分析肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因内含子Ⅱ的多态性及其对绵羊生长性状的影响,筛选对绵羊生长发育有显著影响的分子标记,以期为绵羊的分子育种提供参考。【方法】 选取大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊5种绵羊为研究对象,采用PCR-RFLP技术对MyoG基因内含子Ⅱ(Eco72 Ⅰ)进行基因分型,利用PopGene32软件计算绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的群体遗传多样性,利用SPSS 17.0软件对不同基因型与绵羊生长性状进行关联分析。【结果】 小尾寒羊、杜泊羊、湖羊群体中MyoG基因内含子Ⅱ均存在3种基因型:AA(368/540 bp)、AB(908/368/540 bp)和BB(908 bp);大尾寒羊和豫西脂尾羊群体中仅检测到2种基因型:AB(908/368/540 bp)和BB(908 bp)。大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊的AB基因型频率分别为0.845、0.633、0.917、0.706和0.811,BB基因型频率分别为0.155、0.033、0.083、0.176和0.054,AA基因型频率分别为0、0.333、0、0.118和0.135。小尾寒羊的杂合度最低(0.455),杜泊羊的杂合度最高(0.497),表明杜泊羊的遗传多样性要高于其他群体;5个群体多态信息含量(PIC)均为中度多态(0.25<PIC<0.5)。关联分析发现,小尾寒羊MyoG基因内含子Ⅱ BB基因型个体胸围、胸宽、头长、颈长均显著低于AA、AB基因型(P<0.05)。【结论】 MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点可作为影响绵羊生长性状的分子标记,结果可为今后绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供参考。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

东佛里生羊MSTN基因多态性及其与生长性状的关联分析

试验旨在研究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因多态性及其对东佛里生羊生长性状的影响。从324只东佛里生羊全血中提取DNA,对MSTN基因外显子序列和非翻译区(untranslated region,UTR)序列进行PCR扩增,采用一代测序技术鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,分析不同位点的遗传多态性,并将不同基因型与东佛里生羊的生长性状进行关联分析。结果显示,在东佛里生羊MSTN基因外显子中未检测到突变;在3'-UTR区的272 bp处存在G→A单碱基突变,该位点只检测到AG和AA基因型,且AA基因型频率高于AG基因型;在5'-UTR区的176 bp处存在C→A突变,该位点只检测到CC和AC基因型,且CC基因型频率高于AC基因型。遗传多样性参数分析结果表明,东佛里生羊群体MSTN基因3'-UTR-272和5'-UTR-176位点的纯合度分别为0.827和0.887,杂合度分别为0.173和0.113,2个位点的多态性均较低(PIC<0.25),其群体基因型分布均符合哈代-温伯格平衡(P>0.05)。关联分析发现,3'-UTR-272位点AG基因型体斜长显著高于AA基因型(P<0.05),5'-UTR-176位点CC基因型胸围显著高于AC基因型(P<0.05),其余指标均无显著差异(P>0.05)。综上,东佛里生羊MSTN基因3'-UTR和5'-UTR突变位点可作为其目标性状选育的分子标记。