绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。     

短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus purnilus)BP51中克隆得到木聚糖酶基因xynA。将其构建在大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET21a上，转化Ecoli BL21，获得重组工程菌BLX5。经IPTG诱导，xynA基因的表达产物以胞内可溶性蛋白和包涵体形式存在。重组表达木聚糖酶的活力可达165．511U／mL培养物。重组表达的木聚糖酶最适温度为55℃，最适pH值为6．5，在碱性条件下具有良好的稳定性，降解产物以三糖、四糖和五糖为主。     

绿色木霉T206产纤维素酶特性与酶促动力学研究

对分离自霉变玉米穗的产纤维素酶绿色木霉(Trichoderma Viride)T206进行产酶条件、酶学性质及酶促动力学特性研究.结果表明:T206菌株在1%羧甲基纤维素钠为碳源、0.3%蛋白胨和0.2%NH4NO3为氮源,起始pH值为5.0、接种量为6%,28℃培养4 d的条件下产酶量最高.该酶热稳定性强,热变温度为60～80℃,反应的最适温度为50℃,最适pH值为4.5.     

啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化

对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育，获得产β-葡聚糖酶达27．3U／mL的突变株H302。采用均匀实验设计对H302菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验，所获优化配方(W／V)为麦麸1．41％，鱼粉0．80％，硝酸钾0．34％，硫酸镁0．11％，起始pH6．0；用含孢量10^8个／mL的种子菌液按体积比3．3％接种上述液体培养基，在36℃下发酵52h，菌株H302的产酶活力达到115．1U／mL，是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9．4倍。对突变株H302所产β-葡聚糖酶性质的研究表明，该酶最适作用温度为60℃，最适作用pH为5．5，适用于啤酒生产中的麦芽糖化。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

木霉β—1，3—1，4—葡聚糖酶性质及其cDNA片段克隆

本研究探讨了里氏木霉GXC的-1,3-1,4-葡聚糖酶特性，克隆和分析了酶基因片段。结果表明，粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG-25、SephadexG-100和DEAE-SephadexA-50柱层析得到纯-1,3-1,4-葡聚糖酶；经12.5%SDS-PAGE凝胶电泳表明，该酶的分子量为35.21kD；酶最适反应pH5.0，最适反应温度为60℃；Michaelis-Menten动力学分析表明，-1,3-1,4-葡聚糖酶的Km和Vmax分别为10.86mg/mL和14286mol/(minmg)。通过RT-PCR方法扩增并克隆了-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段，测序表明,该片段长度为280bp；同源性分析显示，该cDNA片段与水解淀粉芽孢杆菌、厌氧真菌OrpinomycesstrainPC-2、枯草芽孢杆菌中的-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因片段有较高的同源性，分别为90%，79%，91%。     

苦荞苯丙氨酸解氨酶基因(FtPAL)的原核表达及其逆向催化酶学性质分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是植物中广泛存在的苯丙烷代谢途径的第一个关键酶,在生物化工领域可利用其逆向催化性质生产L-苯丙氨酸(L-Phe),而筛选活力高和稳定性好的PAL酶源是提高L-Phe产量的重要途径。本研究以苦荞(Fagopyrum tataricum)苯丙氨酸解氨酶基因(FtPAL)为材料,构建其原核表达融合载体pET-30b(+)-FtPAL,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,表达产物纯化后分析其逆向催化的酶学性质。结果FtPAL基因获得了有活性的表达,正向催化比活力在第5小时最高达24.17 U/mg,纯化后正向和逆向催化比活力分别为158.74 U/mg和194.11U/mg,薄层层析也证明,FtPAL可逆向催化肉桂酸氨化为L-Phe。酶学性质分析表明,FtPAL逆向催化的最适温度为30℃,热不稳定,最适反应pH为10,此时有较好的稳定性,除Mg2+对其具有激活作用外(P0.01),其它金属离子(Na+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Ca2+)均具有抑制作用(P0.05或P0.01),Hg2+则可使该酶完全失活。本研究明确了该酶具有合成L-Phe的性质,也为对进一步采用基因工程手段提高其催化能力和稳定性提供了基础资料。     

灰棕紫泥土脲酶动力学及反应条件研究

以底物浓度、pH、温度、培养时间作为处理,采用靛酚蓝比色法测定灰棕紫泥土脲酶动力学参数和反应条件。结果表明,灰棕紫泥土脲酶酶促反应V0与[S]的关系呈二次线性关系,[S]为11.67%时,V0达极大值;Km值在中性、35℃环境下较小,Vmax值在中性环境下较大,与温度呈二次正相关;脲酶酶促反应最适pH值为6.9、最适培养时间为24h、最适底物浓度为10%、最适温度为45℃。     

枯草芽胞杆菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶热稳定性改造及酶学性质分析

利用定向进化技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-1A5的β-葡聚糖酶基因进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。获得了2株可以产较高热稳定性酶的突变体,分别被命名为EGs1和EGs2。酶学性质分析结果显示,与野生酶相比,EGs1和EGs2突变酶的半失活温度分别提高了3和5℃,达到了65.5和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃,达到了60℃;2个突变酶对地衣多糖的水解能力分别提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力未见改变;野生酶和EGs1突变酶最适pH6.5,而EGs2突变酶最适pH7.0;野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH6.0～8.5的范围内放置48h,仍保持80%以上的酶活力。遗传稳定性检验结果表明,突变株的遗传稳定性良好。     

费氏弧菌β-内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析

以费氏弧菌（Vibrio fischeri）EM17基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆了该菌的β-内切葡聚糖酶基因（GenBank Accession Number : EF533943）。将其插入到表达载体pGEX-6p-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达。测序结果经DNAMAN软件分析，该基因与GeneBank中费氏弧菌 ES114基因组预测的β-内切葡聚糖酶基因同源性达到97.1％，但与GeneBank中其他β-内切葡聚糖酶基因同源性较低。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为9.0。同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在 Mg2+，Ca2+对酶有激活作用，Mn2+, Pb2+则严重抑制该酶的活性。     

两株蜡样芽孢杆菌α-淀粉酶差异性分析及基因的克隆表达

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶（α-amylase）的优良菌株。通过对两株蜡样芽孢杆菌（B905和B904）分泌的α-淀粉酶酶学性质研究,淀粉酶的活性稳定温度都在90℃-100℃,耐热性和酶活都不依赖Ca2＋,其它理化性质较为一致,但淀粉酶的分子量大小有明显的不同。PCR方法克隆得到了这两种耐高温淀粉酶的基因全长（amy905和amy904）,并在大肠杆菌诱导表达,结果显示：amy904基因长度为1362bp,其蛋白分子量约为55 KD;amy905基因长度为1761bp,其蛋白分子量约为68 KD。     

重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析

鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。     

重组甘蔗1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶的纯化及其特性

在IPTG诱导下,重组甘蔗(Sacharum sinensis)1-氨基环丙烷-1-羧基(ACC)氧化酶在体外以包涵体蛋白形式表达。包涵体蛋白经Ni2+-NTA金属螯合层析柱纯化和复性后,获得酶活力高达132.58 nmolC2H4/ mg/h 蛋白。该蛋白在pH 5.5 ~ 8.0 和20 ~ 45 ℃温度范围内比较稳定,最适pH 6.7,最适温度33 ℃;米氏常数(Km )61.77 μmol/L,酶动力学参数（Vm）值0.9647 μmol/min,被一定浓度的CO2和底物ACC所激活,受Mg2+、Cu2+、Zn2+和EDTA抑制。     

纤维素降解菌CMC-4的分离鉴定、诱变和酶学特性研究

从秸秆还田土壤中初筛获得一株高效纤维素降解菌CMC-4,根据菌株形态、理化性质及16S rDNA序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以此为出发菌株,经亚硝酸钠诱变获得一株稳定高产纤维素酶突变株CMC-4-3。对CMC-4和CMC-4-3的产酶条件和酶学性质进行比较分析,结果表明:CMC-4-3纤维素酶活力较CMC-4提高67.5%;其最适产酶条件是:37℃、pH 6.0、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量2.0%、装液量60 ml/250 ml。该菌株所产纤维素酶的最适反应pH为6.0,且在4.0~7.0酶活力较稳定;最适反应温度为50℃,在20~80℃范围内均保持稳定;金属离子Fe~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、K~+对酶有激活作用,其余离子均有不同程度抑制作用,而Cu~(2+)和Ca~(2+)抑制作用最强,酶活力减弱近50%,是该酶的强效抑制因子。诱变前后菌株产酶条件和酶学性质等部分表型发生了变化,而突变菌株显示出了更宽泛的环境适应范围。据此,获得一株高效产纤维素酶、耐受范围广的具纤维素降解能力的地衣芽孢杆菌,而CMC-4-3和CMC-4的表型可作为深入探讨基因型变化的线索。     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)重组蛋白的酶活性和免疫原性检测

通过PCR方法从猪链球菌2型(Streptococcus suis)05ZYH33分离株基因组中扩增出次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因(inosine 5-monophosphate dehydrogenase,impdh),长度1 064 bp.PCR产物和pET28a载体分别经过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,连接,成功地构建了重组表达质粒pET28a-impah,并转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中,经过1 mmol/L IPTG诱导获得表达,蛋白大小35kD.表达蛋白具有良好的抗原性和酶活性.蛋白经过亲和层析纯化后,在37℃,pH7.0～9.0表现出较强酶活性,NADH A_(340)介于0.662～0.816之间.     

Cloning, expression, and characterization of two beta-glucosidases from isoflavone glycoside-hydrolyzing Bacillus subtilis natto

On the basis of the genomic sequence of Bacillus subtilis 168, two beta-glucosidase genes (bglH and yckE) from B. subtilis natto, which has been reported to have high isoflavone glucoside-hydrolyzing activity, were cloned and overexpressed in E. coli M15. The temperature for the optimal p-nitrophenyl-beta-D-glucoside hydrolyzing activity of both enzymes was between 37 and 45 degrees C, but BglH had a higher thermal stability than YckE. Both showed high activity at pH 6.0, but YckE was stable over a wider pH range than BglH. Recombinant BglH was inhibited 73%, 63%, and 43% by 1.0 mM Cd(2+), Fe(2+), or Cu(2+), respectively, while other divalent metal ions resulted in 0-23% inhibition, whereas YckE was inhibited by less than 20% by any of the divalent metal ions we tested. Among the substrate we used, BglH showed the highest affinity for genistin and YckE showed the highest affinity for p-nitrophenyl-beta-D-fructopyranoside. Both BglH and YckE hydrolyzed genistin and daidzin into their isoflavone aglycones, genistein and daidzein, but BglH was more efficient than YckE in isoflavone glucoside hydrolysis (20-fold higher kcat). Our results suggest that recombinant BglH may be applicable in the process of isoflavones deglycosylation.     

产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究

从常年堆放的腐质豆秆中分离到1组产纤维素酶菌群MO,并在50℃、pH8.0条件下培养,90h时达到最高酶活,活性为1.3611IU。该酶最适反应温度为60℃,pH为7.0,在60℃以下和pH3~8范围内具有良好的热稳定性和pH稳定性。在最适反应条件下,该酶的最高活性可达2.13IU。通过生长动力学研究了菌群内部不同生长阶段pH、酶活和失重率的相互关系,并通过非变性电泳对酶谱进行初步研究,得到7条活性条带,说明MO中具有多种产酶菌株。     

Gene cloning and characterization of a novel recombinant antifungal chitinase from papaya (Carica papaya)

A chitinase cDNA clone (CpCHI, 1002 bp) was isolated from papaya fruit, which encoded a 275 amino acid protein containing a 28 amino acid signal peptide in the N-terminal end. The predicted molecular mass of the mature protein was 26.2 kDa, and its pI value was 6.32. On the basis of its amino acid sequence homology with other plant chitinases, it was classified as a class IV chitinase. An active recombinant CpCHI enzyme was overexpressed in Escherichia coli. The purified recombinant papaya chitinase showed an optimal reaction temperature at 30 degrees C and a broad optimal pH ranging from 5.0 to 9.0. The recombinant enzyme was quite stable, retaining >64% activity for 3 weeks at 30 degrees C. The spore germination of Alternaria brassicicola could be completely inhibited by a 76 nM level of recombinant CpCHI. Recombinant CpCHI also showed antibacterial activity in which 50% of E. coli was inhibited by a 2.5 microM concentration of the enzyme.