β–1,3葡聚糖酶基因转化提高苹果对斑点落叶病的抗性

为提高苹果抗病性,利用根癌农杆菌介导的叶片转化法,将带有NPTⅡ筛选基因、GUS标记基因及β–1,3葡聚糖酶目的基因质粒导入‘富士’和‘嘎拉’苹果。具有卡那霉素(Kan)抗性的转化株系,经GUS组织化学染色及PCR扩增检测,得到17个‘嘎拉’阳性株系和11个‘富士’阳性株系。选取‘嘎拉’和‘富士’各3个阳性株系进行Southern blot检测,结果表明外源目的基因已整合到所试转化株系中。选取‘嘎拉’及‘富士’各5个阳性株系进行半定量RT-PCR检测,除1个‘富士’株系没有条带外,其余株系均有阳性条带,且各条带的明亮清晰程度有差别,说明不同转基因株系中目的基因的表达量有差异。转化植株离体叶片接种苹果斑点落叶病菌进行抗病性表型检测结果证实,‘嘎拉’10个转化株系中8个株系表现抗病,7个‘富士’转化株系中2个株系表现一定的抗病性,抗病性的增强与目的基因的表达水平有关。     

8个授粉品种对‘秋富1号’苹果的授粉效应研究

为筛选出‘秋富1号’苹果的适配授粉树,以‘红亮’‘红玛瑙’‘雪莱’‘雪球’‘雪龙’‘红艳’6个专用授粉品种和‘嘎拉’‘秦冠’2个栽培品种的花粉为父本,自然授粉为对照,测定授粉组合的坐果率及7个果实品质指标,并应用隶属函数法对8个授粉品种的授粉效应进行综合评价和排序。结果表明,除‘红艳’外,其他授粉品种对‘秋富1号’苹果的坐果率、着色指数和可溶性固形物含量影响较大,表现出花粉直感效应。综合评价结果为‘秦冠’‘雪莱’‘嘎拉’‘红亮’‘雪球’‘红玛瑙’‘雪龙’‘红艳’自然授粉。     

新疆红肉苹果杂交二代2个功能型株系果实风味品质的评价

【目的】探讨杂交二代(F2)2个功能型苹果优株及对照品种‘嘎拉’的果实风味品质,旨在为新疆野苹果资源的利用保存及功能型苹果育种理论与技术提供基本资料。【方法】以2个功能型苹果优株‘红心7号’和‘红心9号’为试材,以栽培品种‘嘎拉’为对照,对果实的类黄酮组分、糖酸组分、挥发性成分等风味物质的组成和含量进行检测分析。【结果】‘红心7号’与‘红心9号’硬度、Ca、Fe、Zn和花青苷含量及抗氧化能力均显著或极显著高于‘嘎拉’;3个参试材料均以果糖和苹果酸含量最高,2个功能型苹果优株糖、酸总量均显著高于‘嘎拉’;‘红心9号’果实各类挥发性成分种类数和特征香气成分种类数最高,含量以‘嘎拉’最高,但‘红心7号’各类挥发性成分和特征香气成分的种类数及含量均最低;‘红心9号’与‘红心7号’类黄酮含量分别是‘嘎拉’的3.1倍和2.3倍,但‘红心9号’味感偏酸,而‘红心7号’味感甜酸适口,与‘嘎拉’基本一致。【结论】‘红心7号’硬脆多汁,甜酸适口,果实类黄酮、花青苷和Ca、Fe、Zn含量及抗氧化能力均显著或极显著高于‘嘎拉’。因此,从新疆红肉苹果杂交二代分离群体中能够选育出综合品质优良的功能型苹果新品系。     

高温对桃花粉发育及小孢子产生的影响

在人工气候培养箱内对‘锦绣’黄桃（Prunus persica‘Jinxiu’）花器官进行高温处理,利用光学显微镜探讨了高温对小孢子形成和花粉发育的影响。结果表明：与对照相比,35 ℃高温处理1 h 对花粉量影响不显著,随着处理时间增加,花粉量、萌发率以及花粉管生长量显著下降,5 h 高温处理的花粉量仅为对照的1.9%,且基本不萌发;5 h 高温处理部分花粉母细胞减数分裂后不能形成正常的四分体,而形成二分体、三分体以及多分体。随着花药胼胝质的解体,花药内出现了多核小孢子。高温处理后小孢子细胞质收缩解体,随后小孢子壁也解体;高温处理的花药壁细胞染色浅,绒毡层提前解体,说明绒毡层不能继续为小孢子发育提供营养物质,使小孢子发育受阻,造成小孢子逐渐消失。     

肌醇磷脂信息传递系统在苹果花粉萌发和花粉管生长中的作用

以‘富士’、‘国光’苹果的花粉为试材,研究肌醇磷脂信息传递系统在苹果花粉萌发和花粉管生长中的作用。结果显示,肌醇磷酸脂酶抑制剂Ｌｉ＋ 、蛋白质激酶抑制剂Ｈ７ 能显著抑制花粉萌发和花粉管生长,且随其浓度提高,抑制效应增强;Ｌｉ＋ 的效应可被外加肌醇逆转。磷脂酶（ＰＬＣ）抑制剂新霉素仅在高浓度时显著抑制花粉萌发和花粉管生长。此外,上述抑制剂在高浓度时对花粉萌发的初始阶段具显著的抑制效果。加速磷脂酰肌醇分解的脱氧胆酸钠能显著抑制花粉萌发和花粉管生长,而促进肌醇磷脂降解的２ ,４ Ｄ的作用很小。由此表明,肌醇磷脂（ＰＩ） 信息传递系统可能参与了苹果花粉萌发和花粉管生长过程,并可能在花粉萌发的启动过程中具重要调节作用。     

不同授粉组合对苹果果实ASA含量及抗氧化协同酶、糖酸组分动态变化的影响

【目的】讨论不同花粉授粉后的苹果果实在生长发育过程中抗坏血酸(ascorbic acid,ASA)含量、糖酸组分以及抗氧化协同酶活性的差异,明确高效授粉树花粉对苹果果实糖酸组分变化及抗氧化协同酶活性的影响,为高效授粉树的选育和提升苹果果实品质提供依据。【方法】采用自育高效授粉树1379、1539、1-17以及3-21的花粉,在‘富士’(Malus domestica Borkh.‘Fuji’)、‘嘎拉’(Malus domestica Borkh.‘Gala’)铃铛花期时进行授粉,以‘新红星’(Malus domestica Borkh.‘Starkrimson’)花粉为对照,自授粉后20 d的幼果开始每间隔20 d进行连续采样,对苹果果实中ASA含量、有机酸中的草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、枸橼酸含量;可溶性总糖中葡萄糖、果糖、蔗糖以及山梨醇含量、抗氧化协同酶中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性和丙二醛(MDA)含量进行测定。【结果】不同花粉授粉后果实内ASA含量存在显著性差异,均高于对照。在果实生长发育过程中,SOD、POD活性变化与果实内ASA积累量变化趋势相同,呈先降低、后升高、再降低的趋势;CAT活性逐渐降低,MDA含量变化呈先降低后升高的趋势,其中经过高效授粉树花粉授粉的果实内MDA含量均低于对照,而果实中抗氧化协同酶的活性均明显高于对照。在果实生长发育中后期,不同高效授粉树花粉授粉后的果实内总酸含量低于对照,而其中的草酸和酒石酸含量高于对照,苹果酸、枸橼酸和琥珀酸含量低于对照;糖组分含量均高于对照,其中果糖和蔗糖含量较对照有显著的提高,但不同授粉处理间的糖酸组分含量差异不显著。【结论】不同高效授粉树花粉均能显著提高苹果果实内ASA含量,但不同处理间ASA含量差异不显著;经过高效授粉树花粉处理的果实内草酸和酒石酸含量较对照有所提高,但是总酸含量较低;同时不同高效授粉树花粉授粉果实内的果糖和蔗糖含量较对照有显著的提高,但不同高效授粉树花粉授粉处理间的糖酸组分含量差异不显著。其中抗氧化协同酶活性与ASA积累量变化趋势相似,推测其活性与ASA含量具有一定的关系。     

10个新疆梨品种开花生物学及果实品质特征研究

了解新疆梨品种的开花生物学及果实品质特征,为其合理利用提供数据参考。在10个新疆梨品种的生殖生长期,对开花物候期、花部特性、花粉特性及果实品质特性等进行测定对比分析。结果表明:除‘艾温切克’‘库尔勒黄酸梨’外,其他8个品种花期一致,但果实成熟期有明显差异;‘库尔勒香梨’与其他品种的花器官特征无明显差异;‘绿梨’‘阿克苏句句梨’的花粉活力较强、单花药花粉量较多;‘艾温切克’‘绿梨’等4个品种的单果重较大,显著大于‘库尔勒香梨’;‘艾温切克’的果实硬度最小,与‘库尔勒香梨’无显著差异;‘艾温切克’‘绿梨’的可溶性糖、可溶性固形物、维生素C含量均较高,与‘库尔勒香梨’无显著差异或显著高于‘库尔勒香梨’。综上,‘绿梨’‘阿克苏句句梨’的花期与‘库尔勒香梨’重叠,花粉量较多、萌发率最高,花器官特征与‘库尔勒香梨’接近,可作‘库尔勒香梨’的备选授粉树;‘艾温切克’‘绿梨’的果实品质及口感好、果实成熟期早,且果皮颜色与其他品种有明显差异,可作为优良育种材料。     

Ca~(2+)与苹果花粉萌发和花粉管生长的关系

以苹果的花药、花粉为试材，观测Ca(2+)与花粉萌发和花粉管生长的关系。结果表明，不同品种和花芽萌动期的花药中Ca(2+)含量与花粉萌发率和花粉管长度无明显的相关关系。花粉培养过程中花粉壁渗出的Ca(2+)量与萌发率和花粉管长度呈极显著正相关。10(－4)mol·1(－1)的游离Ca(2+)最有利于花粉萌发，1mmol．1(－1)EGTA对花粉萌发和花粉管生长的抑制作用强于0．1mmol．1(-1)．外源CaCl2、Ca（NO3）2、SrCl2在低浓度时对花粉萌发与花粉管生长的作用不大；高浓度时具抑制效应，并且在同等浓度时，SrCl2的抑制作用最大。     

早熟芽变“嘎拉”与普通“嘎拉”苹果的生物学性状比较

以普通"嘎拉"苹果为对照,对早熟芽变"嘎拉"的生物学性状进行了研究。结果表明:早熟芽变的物候期与普通"嘎拉"基本一致,但成熟期提前25d左右;芽变"嘎拉"树体变矮,分枝变多,节间长、叶宽和叶厚分别为"嘎拉"的1.07、1.16、1.17倍;但分枝长、叶长、叶柄长没显著变化;主干增粗速度变慢。芽变"嘎拉"的花瓣长、宽,花药纵、横径,花柄长度、粗度,花粉萌发率,花冠大小分别为"嘎拉"的0.87、1.16、0.94、1.14、0.63、1.49、0.70、0.87倍。早熟芽变"嘎拉"的平均单果重为206.2g,比对照增加了25.3%;可溶性固形物含量为13.87%,降低了4%;可溶性糖含量为5.55%,比对照降低了9%;可溶性酸含量为0.1%,降低了66.6%;糖酸比为56,提高了267%;果面色泽为条红,着色均匀。综合各项指标认为,该早熟芽变是一个综合性状优良的变异。     

‘新高’梨雄性不育与IAA和ABA含量变化的关系

 以雄性不育的‘新高’梨和可育的‘丰水’梨为试材, 研究花粉发育过程中IAA和ABA含量及其与IAA代谢相关酶和微量元素的变化。结果表明: 丰水花蕾中IAA含量从四分体后极显著地高于新高, 在新高花粉败育期(单核花粉早期到单核花粉晚期) 是新高的3.70～4.47倍, 新高IAA含量的亏缺可能是导致败育的原因之一; 新高在花粉发育前期IAA氧化酶活性显著高于丰水, 而两个品种POD活性变化一致, 差异不显著, 说明POD不是导致新高IAA含量的亏缺的关键酶; 新高Zn含量低于丰水, 而Mn含量从单核花粉期以后却高于丰水; 新高ABA含量从四分体到二核花粉期显著高于丰水, 而丰水在成熟的花药中积累了大量的ABA。     

转MdSOS2L1基因苹果植株根际微生物多样性的研究

以野生型‘嘎拉’苹果和转MdSOS2L1基因植株为试材,利用高通量测序技术研究转MdSOS2L1苹果植株对根际微生物的影响。结果表明,转基因与野生型植株根际微生物群落丰富度和多样性存在较大差异,其中原核微生物群落变化最为明显。转MdSOS2L1植株根际酸杆菌门丰度增加较多,蓝藻、放线菌门丰度略有下降。同时,转基因植株根际土壤pH值低于野生型,并且转基因植株根际土壤的苹果酸、柠檬酸、草酸含量明显升高,两者非根际土无明显差异,转基因植株根际微生物的差异极有可能与MdSOS2L1基因介导的有机酸分泌有关。     

抗菌肽MB39基因导入‘皇家嘎啦’苹果及其四倍体植株的培育

 采用农杆菌介导法, 将抗菌肽MB₃₉基因转入‘皇家嘎啦’苹果, 获得了7 个转基因株系。通过秋水仙素诱变染色体组工程育种技术, 由转化体叶片获得了20 个四倍体植株。经PCR 检测和Southern Blotting 杂交证明, 抗菌肽MB₃₉基因已经整合到皇家嘎啦苹果的染色体组中。转基因株系TR21、TR23 提高了对火疫病的抗性。采用流式细胞技术( Flow Cytometry) 确定植株为四倍体。     

农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究

以皇家嘎拉苹果的叶片为转化受体,通过根癌农杆菌介导将铁结合蛋白(Ferritin)基因导入受体中,诱导获得了抗性芽.经PCR检测从抗Km植株中选择到4株阳性植株,进一步经PCR-Southern杂交证实外源基因已整合到4株苹果基因组中,RT-PCR检测表明,Ferritin基因在4株转基因植株中得到了表达.     

Evaluation of an alternative D-amino acid/DAAO selection system for transformation in apple (Malus × domestica Borkh.)

Summary

The conventional selection system for apple transformation is based on the selectable marker gene, nptII, encoding antibiotic resistance against kanamycin. We tested an alternative selection system based on the use of D-amino acids using the gene, D-amino acid oxidase 1 (dao1) as the selectable marker, in order to avoid the presence of antibiotic resistance genes in the resulting transgenic apple plants. In addition, dao1 allowed the selection as well as the elimination of dao1-transgenic plants, based on differences in the toxicity of different D-amino acids. Regeneration experiments using apple leaf explants revealed that 2 mM D-serine or D-alanine inhibited shoot regeneration. We performed transformation experiments using the apple cultivars ‘Gala’, ‘Holsteiner Cox’, and a progeny of the apple cultivar ‘Pinova’, and the vector p35S::dao1-intron, containing the dao1 and nptII selectable marker genes. Several shoots regenerated successfully on selection media containing various concentrations of D-serine or D-alanine, but transgenic shoots were not obtained. However, three dao1/nptII transgenic apple lines were obtained after selection with kanamycin, indicating that the vector was functional. Furthermore, we showed that 20 mM D-serine could be used to select dao1-transgenic shoots from non-transgenic in vitro shoots, whereas 13 mM D-isoleucine had the opposite effect.     

苹果MdAFS叶绿体定位表达对拟南芥萜类挥发物的影响

以‘青香蕉’苹果(Malus×domestica‘White Winter Pearmain’)α–法尼烯合酶基因(MdAFS)为目标基因,构建叶绿体定位的植物过表达载体,并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,获得使MdAFS在叶绿体中过表达的拟南芥转基因株系。将pBI122-rbcS1-pla-MdAFS-GFP表达载体瞬时表达本氏烟,分析表明叶绿体定位肽能成功将MdAFS蛋白定位到叶绿体中。定量测定莲座期和盛花期拟南芥光合色素,结果显示,转基因拟南芥叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著增加。qRT-PCR分析萜类代谢相关基因转录表达水平表明,尤其在盛花期,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢基因表达上调。应用静态顶空固相微萃取法收集拟南芥挥发物并结合GC–MS分析鉴定萜类挥发物成分,转基因拟南芥中萜类挥发物含量和种类明显增加。这些结果表明,过表达MdAFS能显著影响萜类代谢流的重新定向,增加萜类代谢挥发物。叶绿体是萜类代谢工程一个理想的亚细胞空间。     

标记基因nptⅡ在转基因苹果嫁接砧穗间无相互传导

 以携带外源新霉素磷酸转移酶基因( nptⅡ基因) 苹果品种嘎拉、未进行基因转化的普通型嘎拉和苹果砧木M26组培苗为试材, 通过试管微嫁接方法, 对其体内所含外源nptⅡ基因在砧穗中的传导性进行了研究。结果表明, 外源nptⅡ基因只在转化植株体内表达, 不通过嫁接在接穗和砧木间进行传导。     

苹果MdFT基因对番茄的遗传转化

 通过RT2PCR扩增, 从苹果叶片cDNA中克隆了^FT基因的同源基因^MdFT, 构建了花椰菜病毒35S启动子驱动的MdFT植物表达载体35S: : MdFT, 并利用根癌农杆菌介导法将其导入番茄栽培品种‘中蔬四号’; 同时转化拟南芥A tFT基因作为阳性对照。从添加卡那霉素的筛选培养基上再生了抗性植株,PCR扩增证明, 外源基因MdFT和AtFT已经整合到转基因番茄的基因组, 半定量RT-PCR则证明它们已经在转基因番茄中得到异位过量表达。形态鉴定发现, 转基因番茄植株比非转基因对照植株开花早, 表明成功地从苹果中克隆了成花素基因MdFT, 该基因具有通过转基因缩短苹果树童期的潜在价值。     

利用沙冬青抗寒基因AmEBP1 转化杏的研究

 利用花粉管导入法,将沙冬青抗寒基因AmEBP1 转化到‘大果’杏幼胚中,在改良WPM 培 养基上经卡那霉素筛选,PCR、Southern 检测,结果得到5 个转基因阳性株系;组培苗抗寒试验结果表明, 相同低温（–4 和–8 ℃）条件下,转基因植株均比对照表现出较高的成活率;随着处理温度的降低,转 基因株系REC 与MDA 含量始终低于对照植株;转基因植株的低温半致死温度（LT50）比未转基因对照 低2.13 ℃。试验结果表明导入的AmEBP1 基因提高了‘大果’杏的抗寒性。     

紫斑牡丹花粉发育的细胞形态学研究

紫斑牡丹花粉具二型性，正常花粉占８４．３％，异常花粉占１５．７％。正常花粉的发育可划分为单核小孢子早期、单核小孢子晚期、花粉第一次有丝分裂期、２－细胞花粉早期和２－细胞花粉晚期（成熟期）等５个时期；异常花粉在单核小孢子晚期开始分化，其中大部分逐渐停滞发育，少数（不超过１％）可在体内启动雄核发育途径，朝着形成孢子体的方向发展。