MDCK细胞库的建立及其生物学特性研究

分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、北京协和细胞资源中心及某企业引进4株MDCK细胞系,扩大培养后液氮冻存,分别建立种子细胞库和工作细胞库。细胞复苏后分别对每株细胞进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果表明,4个来源的MDCK细胞均呈上皮型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体检测都为阴性;染色体2n=78;外源质粒在该细胞中能进行复制和表达。建立的细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了基础理论依据和细胞资源。     

适应H9亚型禽流感病毒增殖的MDCK悬浮细胞株的驯化及其生物学特性

本研究通过筛选驯化的MDCK细胞获得无血清悬浮生长MDCK细胞(命名为MDCK-sus),测定该细胞的比生长速率、细胞活力及细胞最大生长密度等生长特性,采用间接免疫荧光法和流式细胞仪检测法比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞流感病毒受体[唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体(SAα2,3Gal)和唾液酸-α-2,6-半乳糖糖链受体(SAα2,6Gal)]的丰度,用荧光定量PCR检测比较细胞中α-2,3唾液酸转移酶(ST3Gals)基因与α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gals)基因表达水平的差异,通过测定流感病毒血凝HA效价比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞对流感病毒的增殖能力。结果表明,经驯化获得的适合无血清悬浮培养的MDCK-sus细胞,细胞密度最高可达1ml 3.6×106个细胞,最大比生长速率可达1 d 0.56。MDCK-sus细胞表面流感病毒受体SAα2,3Gal的丰度明显高于母体MDCK细胞,ST3Gal转移酶基因表达水平也明显高于母本MDCK细胞。MDCK细胞驯化后增殖禽流感病毒的能力增强,其中H9亚型禽流感病毒AH1102株在MDCK-sus细胞中HA效价达到9lg2(25μl)。MDCK-sus细胞各种生长特性表明,其适于H9亚型禽流感的繁殖,可以为采用悬浮细胞培养禽流感疫苗的大规模工业化生产提供技术支持。     

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化

【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10~(-4),最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL~(-1),根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10~(8.5)TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10~(8.5)EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10~(-2),最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL~(-1)。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。     

基于CRISPR/Cas9系统的MDCK细胞IFN-β1编码序列的敲除

为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。     

MDCK单克隆细胞的制备方法研究

为优化有限稀释法制备MDCK单克隆细胞的参数条件,从而提高有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株的效率。使用有限稀释法制备MDCK单克隆细胞,通过比较不同类型血清、血清浓度和单孔接种密度对制备MDCK单克隆细胞数的影响,确定有限稀释法制备MDCK单克隆细胞的最佳实验条件。结果显示,添加15%胎牛血清、最佳单孔接种密度为1个·孔^-1是制备MDCK单克隆细胞的最佳条件。     

犬瘟热病毒的分离

对流行病学调查、临床症状检查和血清学（ELISA）检测为阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法分别接种于非洲绿猴肾细胞系（Vero）、犬肾细胞系（MDCK）进行病毒的分离.用多聚酶链式反应（RT-PCR）检测感染细胞中的病毒核酸.结果表明,病料接种Vero细胞、MDCK细胞均产生明显的细胞病变（CPE）;用RT-PCR 技术检测病毒感染的细胞培养液,扩增出特异性的产物带,扩增出的片段大小分子长为760bp,与预期设计的长度相同.用Vero细胞同步培养从肠内容物中分离出的病毒命名为犬瘟热病毒GZ1株;用MDCK细胞同步培养从另一只犬的肠内容物中分离出的病毒命名为犬瘟热病毒GZ2株.     

犬肾细胞系的染色体组型分析与致癌/致瘤性的实验研究

 以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 4 5代的完整活细胞或冻融裂解细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的几株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MDCK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 ,只有超二倍体以上细胞才具有高的致癌 /致瘤率 (如YA株的为 2 8/ 5 8) ,亚二倍体细胞的致癌 /致瘤率很低 (其它 3株MDCK细胞的致癌 /致瘤率为 5 / 5 4 ) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。冻融裂解癌细胞系 (X株Hela、JA株Vero、M株BHK 2 1、YA株MD CK)的致癌 /致瘤性相应降低 ,极低致癌 /致瘤性细胞系 (M株或JC株MDCK)不会因冻融裂解而增加致癌 /致瘤性。证明MDCK细胞系冻融裂解物不致癌 ,降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (M ,JB ,JC株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞     

稳定表达鸡氨肽酶N的MDCK细胞系构建及其对传染性支气管炎病毒感染的影响

为研究鸡氨肽酶N(Chicken aminopeptidase N,c APN)在鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染细胞过程中作用,构建稳定表达c APN的MDCK细胞系。将重组质粒pc DNA3.1-c APN通过脂质体转染到MDCK细胞中并利用G418筛选,克隆纯化获得稳定表达c APN的MDCK细胞系。通过RT-PCR和间接免疫荧光检测表明c APN在MDCK细胞中持续稳定表达。IBV可以感染稳定表达c APN的MDCK细胞并连续传代,该细胞系接种IBV阳性样品24 h即可产生典型细胞融合病变,而对照MDCK细胞接种后没有细胞病变出现。结果表明c APN在介导IBV感染宿主细胞过程中发挥重要作用。     

犬五联病毒活疫苗制备用犬肾细胞系的建库筛选与检定

 以人类子宫颈癌细胞系Hela为阳性对照 ,以连传 3代的犬、猫肾原代细胞 (CKC、FKC)作为阴性对照 ,对来自国内外不同单位收集的另外 4株MDCK传代细胞系培养 2 5～ 6 7代的完整活细胞进行裸鼠致癌 /致瘤实验观察 ,筛选出致癌性极低、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的 2株MDCK细胞系用于制苗 ,并建立了相应的细胞种子库和工作库 ,供科研和生产使用 ,4年运转很好。不同代次MDCK细胞系染色体众数所占比率的相差率一般不超过 5 %～ 15 % ,结构畸变率一般为 0～ 3%。研究表明 ,MDCK细胞染色体遗传特征决定致瘤性质 ,并具有种属特异性 ,MD CK细胞不论核型如何 ,始终具有致癌性 ,但其致癌 /致瘤性差 (2 3/ 5 9) ,且一般致上皮源性恶性肿瘤 ,多为高中分化腺癌。降低制苗毒液中细胞系基因含量 ,完全可以将MDCK细胞系 (WB和H株 )用于犬五联苗生产。MDCK细胞超二倍体YB株和亚二倍体与超二倍体KA株不能用作病毒活疫苗培养基质。找出了MDCK细胞系的染色体变异率、软琼脂中克隆形成率、对植物凝集素的凝集性和在裸鼠体内形成癌肿的潜力之间的可能相关性 ,发现细胞系染色体数目增加、克隆形成率增高、凝集性增强 ,则致癌 /致瘤性相应提高     

抑制钙信号转导对柔嫩艾美耳球虫入侵细胞的影响

 【目的】探讨柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）入侵细胞与钙信号转导之间的关系,揭示鸡柔嫩艾美耳球虫病的发生机制。【方法】采用体外狗肾细胞（madin-darby canine kidney cell,MDCK细胞）培养技术,检测了细胞外缺钙、Ca2+内流阻断剂（硝苯地平）和钙调蛋白抑制剂（三氟拉嗪）对E. tenella子孢子入侵率的影响,并测定了培养细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）和细胞活性。【结果】E. tenella子孢子入侵细胞的抑制率随着细胞外Ca2+浓度的降低而升高。钙离子浓度降低到600 μmol•L-1时,入侵率（23.33%）均极显著低于对照组（P＜0.01）;细胞外无钙时,入侵抑制率高达53.18%;硝苯地平和三氟拉嗪均能极显著抑制子孢子的入侵（P＜0.01）,其中10 μmol•L-1的硝苯地平和50 μmol•L-1三氟拉嗪分别对子孢子的入侵抑制率达71.41%和97.13%,二者合用入侵抑制率可达98.59%。在E. tenella子孢子入侵细胞的过程中,MDCK细胞的活性均在90%以上,与对照组差异不显著（P＞0.05）,接种E. tenella子孢子的MDCK细胞培养液中LDH的活性与未接种的活性差异不显著（P＞0.05）。【结论】细胞外钙缺乏、钙通道阻断剂硝苯地平和钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪对E.tenella子孢子入侵MDCK细胞均有抑制作用,但子孢子入侵对MDCK细胞的活性无明显影响。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

不同培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果研究

[目的]比较3种培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果。[方法]采用DMEM+10%血清、低血清培养基(MEM-MD-611)、无血清培养基(SFE4Mega)3种培养基制备MDCK细胞单层,分别接种不同稀释度的H9亚型禽流感病毒。然后,分别加入含10μg/ml胰蛋白酶的3种培养基作为维持液,培养病毒,每隔24 h观察其细胞病变,并测定上清HA滴度。[结果]在培养72～96 h时,无血清培养基病毒液的HA滴度高于低血清培养基,而低血清培养基则高于含血清培养基。[结论]3种培养基均可用于制备禽流感病毒抗原,其中无血清培养基、低血清培养基更适用于流感病毒抗原的制备。     

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。     

H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

将禽流感病毒(AIV)接种犬肾上皮细胞(MDCK),24h后以鸡抗禽流感抗体和兔抗鸡荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA),结果于细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。利用96孔细胞板培养MDCK细胞,以间接免疫荧光作为判定指标对禽流感病毒进行毒力测定,并与禽流感病毒通用荧光反转录-聚合酶链反应(荧光RT-PCR)检测方法进行比较。结果表明间接IFA、荧光RT-PCR对同一样品检测的最高稀释度分别为10-5.25TCID50和10-6,Ct<30,两种方法对禽流感病毒的检测敏感性均很高。但由于荧光RT-PCR仅对抽提的RNA进行检测,而间接IFA是对禽流感活病毒进行检测,因此在临床样品检测和动物产品检疫中间接IFA更具准确性和实用性。     

利用流式细胞术检测H4亚型禽流感病毒感染细胞

以不同稀释度的H4亚型禽流感病毒(AIV)感染MDCK细胞,分别在添加与不添加TPCK-胰酶的培养基中培养36 h后收集细胞。经固定后,加入抗H4亚型AIV的单抗2C11,继续加入荧光标记的抗鼠Ig抗体,用流式细胞仪(FCM)分析不同条件下病毒感染的细胞,并用血凝(HA)试验检测细胞培养上清中病毒的HA效价。FCM结果表明:不论加TPCK-胰酶与否,均能引起病毒的感染,且随着感染剂量的增加,含有病毒细胞的比率增加。相比而言,加胰酶后,低剂量感染便可引起病毒在MDCK细胞内大量增殖,并能检测到细胞上清中的病毒。FCM与HA试验相比,FCM试验更敏感,更能反应病毒在感染早期的增殖情况。     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

比格犬MC4R基因与肥胖的关系研究

[目的]探讨犬黑素皮质素受体-4(MC4R)基因与肥胖的关系。[方法]通过PCR-RFLP技术分析犬MC4R基因多态性与体重的关系。通过载体构建和细胞培养技术来构建犬MC4R基因的真核表达载体并转染MDCK细胞,研究该基因的体外表达情况。最后通过小鼠尾静脉高压注射重组真核表达载体的方法进行动物试验。[结果]比格犬226 bp C/A多态性与体重呈显著相关。犬MC4R基因在MDCK细胞内成功表达。MC4R重组体裸质粒注射后小鼠的体重有明显变化。[结论]MC4R基因能够促进小鼠的体重增加。该基因与肥胖的发生密切相关,将为肥胖机制的研究提供理论依据。     

胎牛血清和新生牛血清体外培养动物细胞的效果比较

为了比较进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新生牛血清的细胞培养效果,以2批进口胎牛血清、3批国产胎牛血清和2批国产新生牛血清为试验材料,采用细胞贴壁传代培养、最大增殖浓度和倍增时间以及集落形成率3种方法,比较了7批供试血清对VERO、CHO-K1、MDCK和Hela 4种细胞的培养效果。结果表明:连续传代培养时所有牛血清均有较好的促细胞生长的效果;进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新牛血清对4种细胞的平均最大增殖密度为67.8×104、62.1×104和64.8×104 cfu·mL-1,平均倍增时间为22.2、22.5和22.7h;对VERO、CHO-K1和Hela细胞的平均集落形成率为59.2%、57.6%和50.9%。3种牛血清对群体性细胞培养时效果差别不明显,对单细胞克隆培养时胎牛血清优于新生牛血清。     

Further Report on Carcinogenesis or Tumorigenicity of MDCK Canine Kidney Cell(CKC) Lines and Analysis of Their Chromosome Karyotypes

Using Hela cell cultures as positive control and primary canine kidney cell (CKC) or feline kidney cell (FKC) cultures purified in vitro on passage 3 as negative control, the tumorigenicity of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells was tested in ＞273 nude mice, and colony formation in soft agarose and haemagglutination under different concentration of plant lectins of these cells were carried out at the same time. Subsequently, very low tumorigenicity strains of MDCK line were successfully selected; these were evaluated for the production of canine or feline combination viral vaccines, free of infectious agents, and of known cytogenetic and tumorigenic. It is thus evident that MDCK cell of M, JB, JC, WB or H strain can be approved as substrate for the preparation of attenuated viral vaccines, but MDCK cell of YA, YB and KA strains can not be approved as substrate for the preparation of attenuated viral vaccines. The heritable character of these cell sub-lines is comparatively stable, and shows little significant difference between passages.