融合液浓度梯度融合法提高延边黄牛体细胞克隆效率

延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,采用0.28mol/L蔗糖、甘露醇融合液。比较融合液浓度梯度融合法与普通融合法对延边黄牛体细胞克隆效率的影响。实验1,探讨0.28mol/L蔗糖融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(92.98%vs88.55%)、卵裂率(91.07%vs80.96%)、囊胚发育率(40.06%vs30.19%)均显著高于普通融合法。实验2,探讨0.28mol/L甘露醇融合液对体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。结果表明:融合液浓度梯度融合法的融合率(91.22%vs84.89%)、卵裂率(88.02%vs80.42%)、囊胚发育率(39.51%vs29.19%)均显著高于普通融合法。结果表明无论蔗糖还是甘露醇融合液,融合液浓度梯度融合法均能有效提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

融合液浓度梯度融合法不同融合条件对延边黄牛体细胞克隆效率的影响

采用延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,0.28 mol/L蔗糖融合液,融合液浓度梯度融合法对重组卵母细胞进行融合操作,探讨不同融合电场强度、脉冲次数、脉冲时程对延边黄牛体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育率的影响。结果表明,适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的融合电场强度为1200 v/cm;融合脉冲次数为2次;融合脉冲时程为40μs。     

猪卵母细胞电激活方法初探

本实验比较了已报道的4组常用的猪卵母细胞电激活方法,并对电激活参数进行系统探索。结果表明:电激活参数(125 V/mm,80μs,1 DC),激活液0.3 mol/L甘露醇+0.1 mmol/L MgSO4+0.1 mmmol/L CaCl2+0.01%PVA的激活方案,囊胚发育率显著优于其他3组方案(25.6%vs 12.6%vs 21.5%vs 15.2,P<0.05);脉冲电压100 V/mm时3次脉冲激活组囊胚发育率优于2次和1次脉冲组(27.3%vs 16.2%vs 21.7%,P<0.05);激活液中Ca2+浓度(0.1%,0.05%)对激活效果无显著影响,囊胚发育率分别为36.5%和40.9%;本实验结果中电激活效果明显优于化学激活(46.3%vs 29.4%,P<0.05)。通过上述实验本研究建立了一种优化的猪卵母细胞电激活方法,为生产单精子显微注射与体细胞核移植猪奠定了基础。     

R848处理小鼠精子对胚胎性别比率的影响

本实验旨在研究一种省时、快速、高效的性别控制技术,在小鼠获能培养基中添加R848(TLR7/8的配体)以获得性别比例偏斜较高的雌、雄后代。通过添加不同浓度(0、0.3、1、3μmol/L)R848孵育小鼠精液60 min后分离获取上、下层精液,并进行受精能力的评价、运动参数检测以及所获胚胎的性别鉴定。结果显示:R848各浓度组受精率均极显著低于对照组,同时1、3μmol/LR848组精子的受精率低于0.3μmol/LR848组(P0.01);0.3μmol/L组和1μmol/L组上层雄性胚胎占比较对照组均升高(P0.01),0.3μmol/L组和3μmol/L下层雌性胚胎占比较对照组均增加(P0.05);随着R848浓度升高,各处理组上、下层精子活力及运动参数等均不同程度降低。本实验条件下,以添加0.3μmol/L R848孵育的小鼠X/Y精子分离效果最佳且获得的雌雄胚胎比例偏斜更高、更稳定。     

HPLC法测定氨苄西林钠可溶性粉中氨苄西林的含量

采用HPLC法测定氨苄西林钠可溶性粉中氨苄西林的含量.色谱柱为WaterssphericalC18(3.9mm×150mm,5μm),流动相为水-乙腈-1mol/L磷酸二氢钾溶液-1mol/L醋酸溶液(909∶80∶10∶1,V/V),检测波长254nm,流速1.0mL/min,柱温30℃,保留时间约4.5min.氨苄西林在0.25～2.0mg/mL范围内具有良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率99.6%,RSD为0.3%.     

小鼠胚胎DNA氧化损伤模型的建立

为了研究胚胎DNA损伤修复机制,试验以H2O2为DNA损伤诱导剂,建立小鼠胚胎DNA氧化损伤模型,采用不同浓度H2O2培养小鼠受精卵,观察其对小鼠胚胎发育能力的影响;再通过免疫荧光方法检测γH2AX和ρATM蛋白的表达状况,以判断H2O2处理所导致的胚胎DNA损伤情况及较适宜的诱导条件。结果表明:1.5~2.4μmol/L H2O2处理对小鼠胚胎发育能力具有影响,与KOSM(-)对照组相比,H2O2处理组小鼠胚胎的分裂率、囊胚率呈下降趋势,其中1.8~2.4μmol/L H2O2处理组的胚胎分裂率、囊胚率呈显著下降趋势(P0.05)。免疫荧光法检测发现KOSM(-)对照组中,2-细胞期胚胎的γH2AX焦点数多于1-细胞期胚胎,ρATM在两个时期的胚胎中未检测到。γH2AX和ρATM在1.5,1.8μmol/L H2O2处理组的1-细胞期胚胎中均未检测到;2-细胞期胚胎表达γH2AX,未检测到ρATM。2.1,2.4μmol/L H2O2处理组的1-细胞和2-细胞期胚胎均有γH2AX和ρATM表达,其中2.4μmol/L H2O2处理组两个时期胚胎的γH2AX焦点数多于2.1μmol/L H2O2处理组。说明1.5~2.4μmol/L H2O2处理会影响小鼠胚胎体外发育能力,2.1,2.4μmol/L H2O2处理可诱导小鼠胚胎发生DNA双链断裂现象。     

匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合研究

以匍匐翦股颖克罗米和狗牙根新农1号为材料,通过愈伤诱导、继代和悬浮培养,进而细胞融合来探讨草坪草品种改良的新方法.结果表明:(1)匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合时酶解液的最佳组合为:1.5%纤维素酶、0.1%果胶酶、0.7M甘露醇,10h酶解时间,且酶解前应用高渗溶液预处理效果更佳;(2)细胞融合时,原生质体密度2×106个/mL,融合剂由30%的PEG4000、15mmol/L CaCl2·2H2O、0.5mmol/L KH2PO4·H2O、0.5mol/L甘露醇组成,并调pH至7.5效果较好;(3)匍匐翦股颖和狗牙根细胞PEG融合率约为5%,以30min融合时间效果较好,产生的多核融合体少,杂种细胞多呈条形,具有较强的活力.     

活性氧对兔早期胚胎体外发育的影响

研究旨在探讨活性氧-过氧化氢(H2O2)对兔2-细胞期胚胎体外发育的影响。在添加不同浓度过氧化氢的含胎牛血清的TCM-199培养液中,培养兔2-细胞期胚胎的对照组、≤88μmol/L、94μmol/L、103μmol/L≥118μmol/L组的囊胚发育率分别为86%、75%、34%、26%和5%;不同发育时间添加H2O2时对兔2-细胞期胚胎体外发育的影响为第1天处理组(37.14%)、第2天处理组(54.29%)与对照组(91.42%)差异显著。不同发育时间停止H2O2处理对兔2-细胞期胚胎体外发育的影响为第1天不处理组(82.26%)与对照组(97.14%)无显著性差异,但与第2天不处理组(52.50%)和第3天不处理组(30.00%)有差异。可以抑制兔2-细胞期胚胎体外发育的最低过氧化氢浓度为94μmol/L。兔2-细胞胚胎体外发育过程中,16-细胞之前的胚胎对环境中的过氧化氢都敏感,尤其是8-细胞之前的胚胎对环境中的过氧化氢更为敏感。     

SC1(pluripotin)对昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的影响

比较了在无血清培养体系中分别添加小分子化学物质pluripotin(SCl)和白血病抑制因子(LIF)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度.以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)为饲养层,以含LIF的添加血清替代品(KSR)的培养基(ESC-SR)为对照,分别用SC1浓度为0.3、1、3μmol/L的ESC-SR培养液对昆明小鼠胚胎进行分离培养.结果显示:胚胎在添加3 μmol/L SC1的ESC-SR培养液中ICM形成率显著高于对照组(P＜0.05),形成的ES集落与对照组形态差异不明显,最高传至第7代,并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态.不同浓度SC1培养液中,胚胎在SC1浓度为0.3 μmol/L组的F2代形成率显著高于1 μmol/L组和3μmol/L组(P＜0.05),所分离的细胞AKP染色呈阳性,Oct4、Nanog和Sox2的免疫荧光染色均显阳性,具有ES细胞的特点.结果表明,ESC-SR培养液中SC1可以替代LIF用于小鼠ES细胞未分化状态的维持,并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养.     

虾青素对小鼠早期胚胎发育及相关基因表达的影响

试验旨在研究培养液中添加虾青素(AX)对小鼠胚胎体外发育和相关基因表达的影响。试验选用23～25 g的ICR系雌性小鼠,利用超数排卵,取卵母细胞进行体外受精,受精1 h后将受精卵随机分组、分别移入浓度为0、5、10、25、50μmol/L的虾青素培养液中进行体外发育培养,在培养24和96 h后分别观察并统计各组的卵裂率和囊胚率;体外培养至96 h后,对囊胚进行细胞计数,统计囊胚细胞数差异;提取各组囊胚总RNA,利用实时荧光定量PCR技术对各组胚胎的TGF-β和Bcl-2基因的相对表达量进行检测。结果显示,添加10μmol/L虾青素能够改善小鼠胚胎体外发育环境且显著提高胚胎卵裂率和囊胚率(P0.05);显著提高囊胚的细胞数(P0.05);极显著提高TGF-β基因表达量(P0.01)。结果表明,添加10μmol/L虾青素有利于小鼠胚胎体外发育,可用于改善小鼠胚胎体外发育环境;TGF-β和Bcl-2基因很可能参与了胚胎发育过程中的相关调控。     

高效液相色谱法测定甲氧苄啶含量

建立甲氧苄啶含量高效液相色谱测定方法。采用Diamonsil C18色谱柱(200mm×4.6mm,5μm),以甲醇∶0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为25℃,检测波长为271nm。甲氧苄啶对照品浓度在10μg/mL～160μg/mL范围内与峰面积呈线性关系,线性回归方程A=0.389 2C-0.369 6,r=0.999 9(n=5);平均回收率为99.61%,RSD=0.41%(n=5)。高效液相色谱法快速、简便,专属性强,重现性好,准确度高,可用于甲氧苄啶原料含量的测定。     

Attempt to produce nuclear transferred primordial germ cells using electrofusion in domestic chicken

As a step to develop a somatic nuclear transfer technique for avian species, an attempt to produce somatic nuclear transferred primordial germ cells (PGC) in the domestic chicken was carried out. Primordial germ cells and embryonic blood cells (EBC) were collected from 2‐day‐old embryos and the nuclei were transferred from EBC into PGC by electrofusion. The most efficient pearl chain was developed when a 350‐V/cm AC field was applied for 60 s. Cell fusion between PGC and EBC was most effective when 4‐kV/cm DC pulses, 60 µs pulse width, were applied three times to a cell suspension dispersed in 0.2 or 0.25 mol/L saccharose solution. The present results provide basic information for the production of somatic cell nuclear transferred chickens using PGC as the nuclear recipient.     

秋水仙胺对电融合方法体外制备牛四倍体胚胎的影响

通过添加秋水仙胺从而改善电融合方法体外制备牛四倍体胚胎的过程。首先检测牛早期胚胎的分裂时间,并由此确定于体外受精后26~30h时间段内挑选既同期化且优质的2细胞期胚胎用于电融合。电融合参数选取2次直流电压为0.75kV/Cm且脉冲时间60μs。并通过免疫荧光染色监测电融合后细胞核的重组过程。设立电融合对照组和电融合秋水仙胺处理组,处理组在电融合后随即处理0.05mg/L秋水仙胺6h,后彻底洗涤继续体外培养至囊胚期。处理组的融合率（84.4%vs 84.8%）、分裂率（74.3%vs 77.6%）和囊胚率（36.1%vs 39.4%）皆低于对照组,但差异均不显著。获取的囊胚期胚胎的核型分析结果显示,处理组的四倍体制备率显著高于对照组（59.4%vs 26.9%）。综上所述,对电融合后的胚胎处理0.05mg/L秋水仙胺6h显著提高了牛四倍体电融合方法体外制的备率。     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

Effects of chlorogenic acid (CGA) supplementation during in vitro maturation culture on the development and quality of porcine embryos with electroporation treatment after in vitro fertilization

Electroporation is the technique of choice to introduce an exogenous gene into embryos for transgenic animal production. Although this technique is practical and effective, embryonic damage caused by electroporation treatment remains a major problem. This study was conducted to evaluate the optimal culture system for electroporation‐treated porcine embryos by supplementation of chlorogenic acid (CGA), a potent antioxidant, during in vitro oocyte maturation. The oocytes were treated with various concentrations of CGA (0, 10, 50, and 100 μmol/L) through the duration of maturation for 44 hr. The treated oocytes were then fertilized, electroporated at 30 V/mm with five 1 msec unipolar pulses, and subsequently cultured in vitro until development into the blastocyst stage. Without electroporation, the treatment with 50 μmol/L CGA had useful effects on the maturation rate of oocytes, the total cell number, and the apoptotic nucleus indices of blastocysts. When the oocytes were electroporated after in vitro fertilization, the treatment with 50 μmol/L CGA supplementation significantly improved the rate of oocytes that developed into blastocysts and reduced the apoptotic nucleus indices (4.7% and 7.6, respectively) compared with those of the untreated group (1.4% and 13.0, respectively). These results suggested that supplementation with 50 μmol/L CGA during maturation improves porcine embryonic development and quality of electroporation‐treated embryos.     

影响山羊胚胎冷冻效果因素的研究

分别用浓度为1.5 mol/L的乙二醇(EG),1.5 mol/L 1,2-丙二醇(PROH)和1.5 mol/L甘油为冷冻保护液对山羊胚胎进行常规冷冻保存,结果三者对山羊胚胎的冷冻保护效果无显著差异,其中以1.5 mol/L EG的冷冻保护效果为佳。以EFS40为玻璃化液对山羊胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻,其结果与常规冷冻间差异不显著,表明常规冷冻法、玻璃化细管法和OPS法均可用于山羊胚胎的冷冻保存。采用25℃和37℃水浴对常规冷冻和玻璃化冷冻后的山羊胚胎进行解冻,从解冻后的发育效果看,二者间无显著差异,但37℃水浴解冻后的胚胎发育效果略好于25℃。还比较了玻璃化液EFS40中添加FCS和BSA后与不添加其他成分的EFS40对胚胎冷冻保护效果的影响,结果表明添加BSA的EFS40的冷冻保护效果显著地高于不添加其他成分的EFS40,但与添加FCS的EFS40间不存在统计学上的差异。     

牛胚胎原代和继代细胞核移植结果比较

比较了原代和继代核移植的操作各环节以及核移植胚胎在体外发育能力上的差异。通过显微操作将体外受精发育而来的８～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入激活的去核卵母细胞的卵周隙内,并用８０Ｖ/mm、４０us２次电脉冲诱导卵裂球与去核卵母细胞融合,借此进行牛胚胎的原代核移 体外发育来的８～３２细胞期的原代核移植胚胎作为供体,用原代核移植相同的方法进行牛胚胎的继代移植。原代核移植的存活率和融合率（８７．３％和６８．５     

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D_{600 nm}值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×10⁴ CFU/μg DNA。     

核移植前激活受体卵子对牛核移植卵体外发育的影响

本研究探讨了核移植前对受体卵子进行激活、细胞融合开始时间及供体受精卵细胞周期调节对核移植卵体外发育的影响。其结果显示核移植前对受体卵子激活组的细胞融合率与对照组没有差异 ,但重组胚胎的卵裂率、8～ 16细胞期胚胎及囊胚的发育率比对照组明显提高 ;核移植前激活的受体卵子分别在卵子体外成熟开始的第30h和 4 5h与供体细胞进行细胞融合 ,结果 ,30h组的细胞融合率和卵裂率与 4 5h组没有差异 ,但发育到 8～ 16细胞期及囊胚的发育率均比 4 5h的高 ;将供体受精卵用诺考达唑 (Nocodazole)处理后 ,进行核移植的结果 ,处理组的细胞融合率、卵裂率、发育到 8～ 16细胞期和囊胚的发育率与对照组无差异