一例牛病毒性腹泻病例的血清学诊断

牛病毒性腹泻病毒是危害养牛业健康发展的瘟病毒属成员。文章对图们市长安镇畜牧兽医站接待病例的诊断过程进行了描述，通过猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测患病牛体内“牛病毒性腹泻抗体”水平，从而为诊断牛病毒性腹泻病例提供了一种有意义的检测手段。     

牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用

本研究在牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的保守区设计并合成了1对引物,建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数R2为0.999,扩增效率为95.9%,熔解曲线为单一峰值,可检测到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹泻病毒核酸,是常规RT-PCR方法敏感性的100倍。该检测方法与猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应;批内与批间重复性试验变异系数均小于2.2%。本试验建立的荧光定量PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时,应用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒RNA定量检测结果表明,胸腺等淋巴组织的病毒含量最高,证实病毒主要侵害淋巴器官,此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。     

牛传染性鼻气管炎及病毒性腹泻流行病学调查及防控建议

为了解牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻在昆明地区的感染情况和流行趋势,该研究于2021—2022年采用实时荧光PCR方法对昆明市16个乡镇61家肉牛规模殖场的1394份棉拭子样品进行牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻病毒核酸检测。结果显示,2021年,牛传染性鼻气管炎病毒核酸个体阳性率0.23%、场群阳性率为2.78%,牛病毒性腹泻病毒核酸个体阳性率0.35%、场群阳性率为2.78%;经及时指导养殖场淘汰阳性病牛,2022年牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻病毒核酸全部为阴性。可见,及时发现并积极防控对根除牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻具有重要意义。     

快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因序列为参考.设计、优化出一对特异的PCR引物和一奈TaqMan荧光探针,建立一种快速定量检测牛病毒性腹泻病毒的实时荧光定量PCR技术.该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍,并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率.因此.该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优...     

牛病毒性腹泻病毒诊断方法与防治措施

牛病毒性腹泻病毒是牛的易感病毒性传染病,传播迅速,易感性强,牛病毒性腹泻病毒宿主范围很广,除了主要感染牛以外,还可以感染羊、鹿、骆驼和猪。本文主要对牛病毒性腹泻病毒的诊断方法与防治措施进行简要综述,为基层动物疾病防控工作人员及牛饲养人员提供借鉴与参考。     

牛巴泰病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

本研究以牛巴泰病毒(BATV)NM/12株作为诊断抗原,初步建立了BATV间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测方法,并对反应条件进行初步优化。结果表明,该方法对赤羽病毒阳性血清、牛布鲁氏杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清无交叉反应,仅与BATV阳性血清发生特异性反应,表明其特异性较强;经敏感性试验测定,阳性血清1∶640倍稀释时检测仍为阳性,显示其敏感性高。应用该方法对内蒙古自治区、黑龙江省和吉林省的523份牛血清进行牛巴泰病毒血清流行病学调查,总阳性率为10.7(56/523),阳性检出率与临床普遍使用的中和试验符合率为100%。本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为牛群抗体检测和BATV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT—PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHV-I）的基因序列,应用Primer Premier5．0软件设计了一对引物,建立了适合DHV—I快速检测的RT—PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT—PCR扩增,得到了预期大小为699bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-I的相应基因序列比对分析,同源性均达90％以上．表明为DHV—I的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明．最低RNA模板检出量为24pg。表明所建立的RT—PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。     

牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系

【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40~400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒,经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株动物回归试验

【目的】自流产奶牛粪便及血液中分离得到的非细胞病变型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV),为了解分离毒株的特性,进行回归动物试验;【方法】将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检,观察临床症状及病理变化。自犊牛体内采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞进行培养,分离病毒,进行细胞传代,将此细胞毒进行RT-PCR检测;【结果】犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。自病料分离病毒经MDBK细胞盲传至第9代,均未出现细胞病变。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段;【结论】将分离株接种易感犊牛以复制出BVD-MD病症,并从试验牛体内分离得到BVDV,从而进一步确证分离到的毒株属BVDV。     

牛肠道病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。     

宁夏部分地区犊牛7种腹泻相关病毒的检测及分析

【目的】调查分析宁夏地区规模化奶牛场牛腹泻相关轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛环曲病毒（BToV）、牛诺如病毒（BNoV）、牛星状病毒（BAstV）、牛库布病毒（BKV）的感染情况。【方法】用RT-PCR方法对采集自宁夏部分地区的6个规模化奶牛场共计81份犊奶牛腹泻粪便样本进行检测，同时扩增相关基因进行分析。【结果】81份样本中BRV阳性率为16.05%，BCoV阳性率为13.58%，BToV阳性率为2.47%，BKV阳性率为2.47%，BVDV、BAstV、BNoV均无检出。BRV和BCoV的混合感染率为3.70%，BKoV和BToV的混合感染率为1.23%。遗传进化分析表明宁夏地区流行的BRV有G6型毒株，并且BCoV毒株具有不同的遗传进化趋势。【结论】BRV、BCoV仍是宁夏规模化奶牛场内最主要的犊牛腹泻病毒，同时检测到BToV和BKV，丰富了宁夏地区牛腹泻病原谱，为宁夏地区奶牛腹泻的综合防治提供了依据。     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用

根据猪瘟病毒5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关系,且重复性好,批间变异系数小于1%。用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒,结果均为阴性。用该方法检测采集自江苏和新疆的192份组织和血清样品,猪瘟病毒阳性率为71.9%;检测感染猪的不同脏器,发现在心、肺、肝、肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可以检测到猪瘟病毒,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高。该方法的建立为猪瘟病毒的流行病学调查和定量提供了有效手段。     

G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定

轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内引发多种幼龄动物及婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原之一,给畜牧业发展和人类健康造成严重危害。通过RT-PCR对来自宁夏犊牛腹泻粪样进行检测,选取阳性样品经MA104细胞进行病毒分离。细胞盲传4代后出现CPE,至7代后细胞CPE现象明显,获得1株牛轮状病毒,扩增VP7、VP4基因并测序分析,结果表明该分离株属于G6P[5]型轮状病毒,命名为NX28。研究明确了G6P[5]型在国内牛群中的存在及流行,并为下一步的牛轮状病毒的分子流行病学研究奠定基础。     

牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展

牛病毒性腹泻病毒主要侵害牛,尤其是犊牛,引起以腹泻(急性感染症状)和黏膜病(慢性持续性感染症状)为临床特征的疾病,给养牛业造成了巨大损失。为此,主要就牛病毒性腹泻的病原特征、分子及血清流行病学概况进行了综述。     

牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立

[目的]为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法.[方法]重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达; Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度.[结果]重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7;,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测, 检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55;.[结论]以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础.     

Development of a sandwich Dot-ELISA for detecting bovine viral diarrhea virus antigen with E2 recombinant protein

The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO₄. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL⁻¹, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and 45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL⁻¹. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were 90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily interpreted without an ELISA reader.