二斑叶螨多重抗性品系的选育及其解毒酶活力分析

【目的】明确二斑叶螨对杀虫杀螨剂的多重抗性机制,为延缓二斑叶螨抗性发展及其抗性治理提供依据。【方法】以螺螨酯、甲氰菊酯和阿维菌素为靶标,通过室内抗性汰选获得二斑叶螨多重抗性品系(Mp-R),采用生化分析方法研究了Mp-R和敏感品系(SS)羧酸酯酶(CarEs)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFOs)的活性差异,并估计了其抗性遗传力及相对适合度。【结果】经过连续50代室内抗性选育,二斑叶螨对阿维菌素、甲氰菊酯和螺螨酯的抗性倍数分别为603.03,167.65和51.77倍,其抗性发展趋势分别呈"慢-快-慢","慢-快"及缓慢上升趋势;与敏感品系相比,3大解毒酶活力在二斑叶螨各发育阶段均未见大幅度上升,仅Mp-R品系卵中MFOs比活力上升幅度最大,为SS品系的1.8倍;二斑叶螨对螺螨酯、甲氰菊酯和阿维菌素的抗性遗传力分别为0.020 3,0.038 7和0.064 2;Mp-R品系相对适合度为0.381 8(Rf1),存在一定程度的生殖不利性。【结论】阿维菌素的抗性遗传力最大,具有较高的抗性风险;甲氰菊酯次之;螺螨酯的抗性遗传力最小,抗性风险较低;阿维菌素、甲氰菊脂和螺螨酯混用有利于二斑叶螨抗性治理。     

阿维菌素亚致死剂量对二斑叶螨解毒酶系的影响

【目的】为明确阿维菌素(avermectin)亚致死剂量在不同时间对二斑叶螨(Tetranychus urticae)体内解毒酶系的影响.【方法】采用喷雾法,测定了阿维菌素对敏感品系二斑叶螨雌成螨的亚致死剂量LC10和LC20,并分析了经两种剂量处理后不同时间,其体内谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFOs)和羧酸酯酶(CarEs)的比活力及米氏常数Km和最大反应速率Vmax的变化.【结果】GSTs在LC20处理后6、12、24h和LC10处理后12、24h比活力显著升高;MFOs在LC20处理后12、24h和LC10处理后12h比活力显著升高;CarEs只在LC20处理后12h比活力显著升高;各酶比活力均在处理后12h时达到最大;GSTs和MFOs在处理后24h的米氏常数Km和最大反应速率Vmax均显著高于对照,CarEs的Km值和Vmax与对照差异不显著.【结论】施药12h后二斑叶螨对阿维菌素的解毒代谢作用最强,GSTs和MFOs在对阿维菌素的代谢中起主要作用,而CarEs对阿维菌素的代谢影响较小.     

二斑叶螨内参基因的筛选及解毒酶基因的表达水平

【目的】筛选二斑叶螨（Tetranychus urticae）敏感（SS）和抗甲氰菊酯品系（Fe-R）中合适的内参基因,并通过基因相对表达定量PCR研究二斑叶螨抗性品系解毒酶基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,RT-qPCR）技术,分析二斑叶螨5.8S rRNA、α-tubulin、β-actin、ELF、GAPDH、RPL13a、SDHA和TBP共8个候选内参基因mRNA表达水平的稳定性,并分析二斑叶螨酯酶（Carboxyl/cholinesterases,CCEs）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione s-transferase,GSTs）及细胞色素P450单加氧酶（Cytocheome P450 monooxygenases,P450s）等主要解毒酶基因相对表达量。用GeNorm和NormFinder软件进行内参基因稳定性评估,通过比较Ct值的方法进行基因相对表达量计算。【结果】8个内参基因中稳定性最高的为α-tubulin;以α-tubulin为内参基因,二斑叶螨Fe-R品系GSTs 基因TuGSTo1、TuGSTd1及P450s 基因CYP3D2相对表达量均显著高于SS品系,而CCEs 基因TuCCE1的表达量有所降低。【结论】在二斑叶螨SS和Fe-R品系中α-tubulin为理想的内参基因,RT-qPCR研究表明TuGSTo1、TuGSTd1和CYP3D2相对表达量的升高可能是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的分子机理。     

高温对两种叶螨致死作用的研究

于2008年6~7月,在本院进行了高温对二斑叶螨(Tetranychus urticaeKoch)和朱砂叶螨(T.cinnabarinus Boisduval)致死作用的研究。研究结果表明,在32℃、35℃、38℃、42℃4种温度处理4h后,两种叶螨的卵、若螨和雌成螨3个不同发育阶段均表现出不同程度的死亡,其死亡率随着温度的升高而提高;在相同温度下其死亡率高低顺序依次为卵>若螨>雌成螨。高温条件下,二斑叶螨的死亡率要明显高于朱砂叶螨。     

甲氧香螨酯亚致死浓度对截形叶螨Tetranychus truncates解毒酶活性变化的影响

【目的】明确甲氧香螨酯Scopoletin亚致死浓度对截形叶螨解毒酶活性的影响.【方法】采用叶片浸渍法测定了甲氧香螨酯对截形叶螨的亚致死浓度LC_(10)和LC_(30),并分析了用此两种浓度分别处理截形叶螨后2～72 h内共9个不同时间点的谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)和多功能氧化酶(MFOs)的活性变化.【结果】LC_(30)浓度的甲氧香螨酯处理截形叶螨后,GSTs酶活性在2～72 h内显著高于对照,除48 h外显著高于LC_(10)处理;LC_(10)浓度的甲氧香螨酯处理截形叶螨后,GSTs酶活性在24～60 h内显著高于对照,其他时间点与对照差异不明显;LC_(30)浓度的甲氧香螨酯处理截形叶螨后,CarEs酶活性2～72 h内显著高于对照,在24～48 h内显著高于LC_(10)处理,其他时间点差异不显著;LC_(10)浓度的甲氧香螨酯处理截形叶螨后,CarEs酶活性在2～72 h内显著高于对照;LC_(30)浓度的甲氧香螨酯处理截形叶螨后,MFOs酶活性在2、36～48和72 h显著高于对照,在6、24 h显著低于对照,4、12、60 h与对照无明显差异,在2、6、24 h显著低于LC_(10)处理,其他时间点与LC_(10)处理无明显差异;LC_(10)浓度的甲氧香螨酯处理截形叶螨后,MFOs酶活性在2、24、48、72 h显著高于对照,6 h显著低于对照,其他时间点与对照无明显差异.【结论】GSTs、CarEs可能参与了甲氧香螨酯的代谢,MFOs的作用还需进一步研究.     

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐与阿维菌素杀螨活性比较

运用浸渍法和叶片残毒法测定了甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate)和阿维菌素(avermectin)对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus与二斑叶螨Tetranychus urticae种群不同发育阶段的致死作用。结果表明,在相同的温湿度条件下,2种花卉叶螨不同发育阶段对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和阿维菌素的敏感性不同,2种药剂对雌成螨的毒力高于卵,而不同种群对同一药剂的活性差异不明显;甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对2种叶螨雌成螨和卵的活性比阿维菌素低。     

尼氏钝绥螨对二斑叶螨的捕食作用

研究了尼氏钝绥螨(Amblyseius nicholsi)对二斑叶螨(Tetranychus urticae)的捕食作用。结果表明,尼氏钝绥螨雌成螨对二斑叶螨卵和成螨是非嗜食的,对幼螨和若螨是嗜食的。尼氏钝绥螨雌成螨对二斑叶螨各螨态的捕食功能反应曲线均为HollingⅡ型,且对幼若螨的捕食作用最大。其自身密度对功能反应存在密度制约作用。     

二斑叶螨对螺螨酯抗性和敏感品系相对适合度的研究

在24℃条件下,饲养二斑叶螨对螺螨酯抗性品系(R)和敏感品系(S),系统观察2品系的生长发育和生殖情况,构建实验种群生命表,比较其一系列生命、生殖及种群动态参数。结果表明:二斑叶螨抗性品系(R)的孵化率、幼螨成活率、有效产卵量、内禀增长率等均具有不利性,抗性品系(R)相对适合度仅为敏感品系(S)的0.582倍,存在适合度缺陷。     

二斑叶螨抗四螨嗪品系筛选及其解毒酶活力变化

【目的】筛选二斑叶螨对四螨嗪的抗性,并明确其解毒酶的变化。【方法】采用室内生物测定和生化分析方法,研究二斑叶螨对四螨嗪的抗性发展趋势及其解毒酶活力变化。【结果】室内用四螨嗪筛选二斑叶螨21代（Clo-R21品系）,抗性倍数（RR）为122.26;Clo-R21品系对哒螨•四螨嗪和浏阳霉素具有较高的交互抗性,RR分别为21.80和10.66;对阿维菌素、甲氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、三唑锡和苦皮藤生物碱具有低水平的交互抗性,RR分别为6.85、5.45、5.02、3.88、3.48、1.68;对苯丁锡、唑螨酯、噻螨酮具有负交互抗性,RR分别为0.72、0.65、0.55;增效剂磷酸三苯酯（TPP）、顺丁烯二酸二乙酯（DEM）、胡椒基丁醚（PBO）、增效磷（SV1）对抗Clo-R21品系的增效比值分别为1.39、1.70、6.78、1.64;Clo-R21品系体内羧酸酯酶（CarE）、酸性磷酸酯酶（ACP）、碱性磷酸酯酶（ALP）、谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和多功能氧化酶（MFO）分别是敏感品系的2.25、2.04、1.91、1.98和26.68倍。【结论】二斑叶螨对四螨嗪的抗性主要受MFO介导,而CarE、ACP、ALP和GSTs也参与四螨嗪抗性的形成。     

电子束对不同发育阶段朱砂叶螨的辐照效应

在室温(28～35℃)和自然光照条件下,研究不同剂量的电子束对各发育阶段朱砂叶螨(卵、幼螨、若螨、雌成螨)的辐照效应,为朱砂叶螨的电子束辐照检疫提供参考剂量。结果表明,不同发育阶段的朱砂叶螨对电子束辐照的敏感度依次为卵>幼螨>若螨>雌成螨。经0.20 kGy辐照后的卵虽可正常发育,但不能产生下一代,0.30 kGy以上剂量辐照后的卵则完全不能孵化;0.20 kGy辐照可使幼螨发育后产生的F1代不能孵化,0.80 kGy辐照可使幼螨完全不育;0.40 kGy辐照可使若螨发育后产生的F1代不能孵化,1.20 kGy辐照可使若螨完全不育;0.20 kGy辐照便可阻止雌成螨所产卵进一步孵化,1.60 kGy以上剂量才能使雌成螨完全不育。以上结果表明,0.40kGy的电子束辐照可作为有效防治朱砂叶螨入侵的参考检疫剂量。     

氟啶虫胺腈亚致死浓度对桃蚜生长和繁殖的影响

【目的】氟啶虫胺腈属第4代新烟碱类药剂,研究旨在探讨氟啶虫胺腈亚致死浓度对F_0(当代)及F_1(第1代)桃蚜(Myzus persicae)生长发育和繁殖的影响,为氟啶虫胺腈的合理使用提供理论依据。【方法】氟啶虫胺腈对桃蚜的亚致死剂量采用波特喷雾塔法确定,将琼脂铺于玻璃培养皿底部,再将新鲜油菜叶片背面向上铺在琼脂上。挑取15头成蚜至油菜叶片上,置于波特喷雾塔下喷雾,药剂设置7个浓度,处理48 h后检查桃蚜死亡情况,采用POLO-Plus10.0软件计算LC_(10)和LC_(25)。采用建立生命表的方法评估氟啶虫胺腈亚致死剂量对桃蚜生长发育和繁殖的影响。评估药剂对F_0代桃蚜的影响时,分别以LC_(10)和LC_(25)喷施成蚜,48 h后将成蚜移至未着药叶片,单头饲养直至死亡。评估药剂对F_1代桃蚜的影响时,以LC_(10)和LC_(25)处理成蚜,48 h后将成蚜移至未着药叶片待其产蚜,24 h后随机选取初产若蚜单头饲养直至死亡,记录蚜虫存活及繁殖情况。采用SPSS16.0软件分析若蚜发育历期、成蚜寿命、单雌产蚜量及生命表参数差异显著性。【结果】根据室内生物测定结果,氟啶虫胺腈对桃蚜成蚜48 h的LC_(10)和LC_(25)分别为0.012和0.041 mg·L~(-1)。亚致死浓度的氟啶虫胺腈显著降低了F_0和F_1代桃蚜成蚜寿命、单雌产蚜量和产蚜历期,并表现为随药剂浓度增加,成蚜寿命、产蚜历期缩短,单雌产蚜量降低。LC_(10)和LC_(25)浓度处理F_0代桃蚜后,成蚜寿命分别为20.89和15.47 d,均显著低于对照的25.41 d;单雌产蚜量分别为56.51和27.33头,显著低于对照的71.02头;产蚜历期分别为20.74和14.37 d,显著低于对照的25.27 d;F_1代成蚜寿命分别为14.80和9.76 d,产蚜历期分别为12.03和8.59 d,单雌产蚜量分别为46.20和28.23头。与对照相比,LC_(10)浓度的氟啶虫胺腈处理显著延长了F_1代1龄若蚜的发育历期(1.73和2.21 d),LC_(25)浓度的氟啶虫胺腈处理显著延长了2龄若蚜的发育历期(1.43和1.58 d),其余龄期及整个若蚜期发育历期与对照相比均无显著差异。生命表参数分析表明,氟啶虫胺腈LC_(10)和LC_(25)浓度处理后桃蚜净增殖率R_0与对照相比显著降低,R_0分别为47.15、24.55和64.47。【结论】亚致死剂量的氟啶虫胺腈能够显著抑制F_0及F_1代桃蚜的寿命和繁殖力。     

4种植物源杀虫剂对葡萄蓟马的致毒作用

为探讨植物源杀虫剂对烟蓟马的毒力、生长发育和繁殖的影响，采用浸叶法测定4种植物源杀虫剂对烟蓟马2龄若虫和成虫的毒力，分析亚致死浓度对2龄若虫生长发育和繁殖的影响。结果表明：印楝素和苦参碱对2龄若虫的毒力相对较高，LC₅₀分别为6.983 mg/L和9.571 mg/L。印楝素、苦参碱和鱼藤酮的亚致死浓度LC₄₀对2龄若虫期和蛹期有显著延长作用，对化蛹率、羽化率、单雌产卵量和卵孵化率有明显地抑制作用。印楝素LC₄₀对化蛹率、羽化率、单雌产卵量和卵孵化率的抑制作用最强，抑制率分别为23.64%、17.60%、18.37%和12.54%。说明印楝素和苦参碱对烟蓟马的致毒作用较好，低龄若虫（2龄期前）是防治的最佳时期，除发挥2种药剂的毒力外，还可通过亚致死浓度对存活若虫的生长发育和繁殖形成抑制作用。     

氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾主要解毒酶活性与生长繁殖的影响

【目的】甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是一种杂食性害虫,在不同环境、药物等选择压力下表现出不同的生长发育特点。氯虫苯甲酰胺是一种新型广谱的鱼尼丁受体杀虫剂,对鳞翅目害虫杀虫活性强。本研究旨在探究氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾幼虫3种主要解毒酶——羧酸酯酶(Car E)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFOs)活性以及对种群繁殖的影响。【方法】采用饲料混毒法测定氯虫苯甲酰胺对SE-Lab品系、SE-Sel品系的毒力,SE-Sel品系由SE-Lab品系经亚致死剂量LC25连续汰选6代得到;通过浸叶法测定磷酸三苯酯(TPP)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)、胡椒基丁醚(PBO)3种酶抑制剂与氯虫苯甲酰胺协同对SE-Lab和SE-Sel品系的毒力增效作用,提前12 h让试虫取食浸渍过酶抑制剂的叶片,对照组取食用0.1%Triton X-100浸渍后的叶片,再分别测定氯虫苯甲酰胺对使用酶抑制剂与未使用酶抑制剂试虫的毒力;在冰上解剖试虫的中肠和脂肪体,并通过离体酶活性测定,分析氯虫苯甲酰胺亚致死剂量与酶抑制剂对甜菜夜蛾体内的3种代谢解毒酶活力的影响;通过记录试虫各个年龄阶段的生长、死亡、产卵量等数据,参照两性生命表理论分析SE-Lab和SE-Sel品系的两性生命表参数差异。【结果】在3种酶抑制剂中PBO增效作用最强,其对甜菜夜蛾SE-Sel品系和SE-Lab品系对氯虫苯甲酰胺的毒力增效比分别为1.58和1.69。在氯虫苯甲酰胺亚致死剂量连续汰选下,甜菜夜蛾体内3种解毒酶活性均被诱导上升,其中MFOs酶活力上升最显著,SE-Sel品系中肠和脂肪体的MFOs活性相对于SE-Lab品系分别提高了2.07和2.10倍,而经氯虫苯甲酰胺亚致死剂量再次诱导的SE-Sel试虫的MFOs活性亦较SE-Lab品系上升4.02和3.44倍;在使用了酶抑制剂后3种解毒酶酶活力均有下降,其中MFOs活性下降最多,其酶比活力仅为未使用酶抑制剂处理的42.3%—44.8%。与SE-Lab品系相比,SE-Sel品系成虫的产卵前期和总产卵前期变长,而产卵量减少;SE-Sel品系的内禀增长率(r)、周限增长率(λ)和净增殖率(R0)均显著小于SE-Lab品系,SE-Lab品系与SE-Sel品系的r分别为0.18和0.16 d~(-1),λ为1.20和1.17 d~(-1),R0为358.42和203.12 d~(-1)。尽管SE-Sel品系的平均世代周期(T)更长,但是与SE-Lab品系无显著差异。【结论】MFOs可能为甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺解毒代谢过程中的主要解毒酶,在其后续抗性形成中起主要作用;甜菜夜蛾在氯虫苯甲酰胺亚致死剂量作用下,世代周期延长,繁殖力降低,种群增长减缓,氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾有持续控制作用。     

橘小实蝇幼虫解毒酶系基因应对高效氯氰菊酯胁迫的组织特异性表达

【目的】基于橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）转录组数据,系统分析橘小实蝇幼虫解毒代谢酶系基因在受到高效氯氰菊酯持续胁迫时的表达模式,鉴定其中起主要作用的基因,并探讨这些基因组织差异表达的生物学意义。【方法】利用qPCR技术检测橘小实蝇幼虫受到高效氯氰菊酯持续胁迫后,30个解毒代谢酶系（GSTs、P450s、CCEs）基因在整虫、中肠以及脂肪体的表达水平变化情况。【结果】在高效氯氰菊酯持续胁迫作用下,橘小实蝇8个GSTs基因中,其mRNA表达量出现明显上调的主要是Delta家族的4个基因,它们在中肠和脂肪体均出现了5.6-32.5倍的过量表达,而其他家族的GSTs基因经高效氯氰菊酯胁迫后没有出现明显的应激反应。同时,Delta家族的GSTs基因虽然在中肠和脂肪体对药剂胁迫有积极的响应,但是它们的表达在整虫却没有明显的变化。6个CCEs基因在整虫中出现一定程度的上调,其中α-E3基因的表达量上调了4.1倍,但是这些基因在中肠和脂肪体均没有出现上调的情况。16个P450s基因的定量分析结果表明,有多个P450s基因的mRNA的表达出现了上调,且大部分基因属于CYP4和CYP6两个家族。其中,CYP4家族中出现明显上调反应的主要有CYP4D47（中肠）、CYP4E9（整虫、脂肪体）和CYP4P5（整虫、脂肪体）。CYP4AD1的表达量在中肠和脂肪体均有一定程度的上调,而在整虫中没有变化。另外,CYP4S18和CYP4AC4没有出现应激表达或者表达量的变化不明显。CYP6家族中,CYP6A48和CYP6A41在脂肪体的表达量显著上调,分别提高了18.0和9.6倍,CYP6G6和CYP6A50在脂肪体的表达量也有一定程度的上升,而CYP6EK1的表达量虽然在整虫提高了4.8倍,但是在中肠和脂肪体并没有明显的变化。其他家族的P450s基因,如CYP12C2、CYP9F6、CYP12N1和CYP309B1等基因的表达量经高效氯氰菊酯胁迫后在脂肪体中也出现了显著的上调,而CYP317B1的表达量在药剂压力下并没有明显的变化。【结论】橘小实蝇幼虫在应对高效氯氰菊酯胁迫时,体内的解毒代谢酶系基因集中在中肠和脂肪体高水平表达,但存在整体保持平衡的现象,推测橘小实蝇在应对杀虫剂的持续胁迫时,存在趋于平衡的能量分配策略,即通过提高能量的利用效率,减少在抵御外源杀虫剂伤害时额外能量的消耗。这种可以避免出现适合度代价的策略可能是昆虫应对环境压力的一种重要适应机制。     

溴氰虫酰胺对双委夜蛾生长发育、繁殖和营养利用的影响

【目的】研究低剂量的溴氰虫酰胺对双委夜蛾(Athetis dissimilis)生长发育、繁殖和营养利用的影响,明确溴氰虫酰胺对双委夜蛾的控制作用。【方法】采用人工饲料混毒法测定溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫的毒力;利用LC_5、LC_(25)和LC_(50)剂量的溴氰虫酰胺处理双委夜蛾4龄幼虫,观察其对亲代幼虫和蛹的发育历期、成虫寿命、产卵量、化蛹率和羽化率等生长发育指标的影响;测定溴氰虫酰胺处理72 h后对幼虫的近似消化率(AD)、相对取食量(RCR)、相对生长量(RGR)、摄入食物转化效率(ECI)、消化食物转化效率(ECD)等营养利用指数的影响;分析溴氰虫酰胺处理24、48和72 h后幼虫体内糖类、蛋白质和脂质含量的变化。【结果】溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫具有较高毒力,LC_5、LC_(25)和LC_(50)分别为0.13、0.34和0.66μg·g~(-1)混毒饲料;与对照组相比,LC_5、LC_(25)和LC_(50)剂量下双委夜蛾4—6龄幼虫的发育历期分别延长了1.63、1.75和5.48 d,同时蛹的发育历期延长,雌雄成虫的寿命缩短,并显著降低了双委夜蛾幼虫的化蛹率和蛹的羽化率,LC_5、LC_(25)和LC_(50)处理组雌蛹重分别为130.2、127.8和127.5 mg,显著低于对照组的蛹重(146.7 mg),但是对雄蛹重无显著影响。溴氰虫酰胺处理后,LC_5、LC_(25)和LC_(50)组的单雌产卵量分别为558.8、506.9和462.8粒,显著低于对照组(755.1粒)。同时,溴氰虫酰胺处理组缩短了成虫的产卵历期,但是对成虫产卵前期的影响不明显。此外,与对照组相比,LC_5、LC_(25)和LC_(50)剂量的溴氰虫酰胺显著降低了双委夜蛾4龄幼虫的RGR、RCR、ECI和ECD,降低了幼虫将食物转化为生物量的能力;溴氰虫酰胺处理双委夜蛾4龄幼虫24 h后显著降低了其体内碳水化合物的含量,而且这种不利影响持续到48 h和72 h,同时,溴氰虫酰胺处理也显著降低了4龄幼虫体内脂质和蛋白质的含量,阻碍了双委夜蛾幼虫正常的生长发育和繁殖。【结论】较低致死剂量的溴氰虫酰胺可以抑制双委夜蛾种群的生长发育和繁殖,有利于长期有效控制双委夜蛾的发生。     

朱砂叶螨TcGSTM7的体外表达及其功能

【目的】朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种重要的农业害螨,长期化学防治导致其对多种药剂产生了抗性,因此明确该螨对化学药剂的解毒代谢机制对开展有效的抗性治理具有重要意义。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是节肢动物主要的解毒代谢酶之一,笔者前期研究中筛选出了朱砂叶螨体内高表达的一条GST基因TcGSTM7,该基因的表达在药剂处理下具有明显的可诱导性。因此,本研究以TcGSTM7为研究对象,进一步利用异源表达技术分析TcGSTM7重组蛋白和甲氰菊酯、丁氟螨酯的互作效应,以及利用RNAi沉默该基因的表达后,检测朱砂叶螨对这两种药剂的敏感性变化,为明确TcGSTM7在药剂代谢中的功能打下基础。【方法】利用NCBI数据库对TcGSTM7编码蛋白的序列特征进行注释,并在SWISS MODEL构建的蛋白三维结构中对相关结构域、结合位点以及活性中心等进行展示。利用异源表达系统在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达TcGSTM7重组蛋白,对重组蛋白进行分离纯化后使用特异性底物检测其GST催化活性,并通过检测杀螨剂对该蛋白活性的抑制效果分析其与甲氰菊酯和丁氟螨酯的互作效应。在此基础上,为明确TcGSTM7基因表达水平对朱砂叶螨药剂敏感性的影响,参照该基因的序列设计并合成特异dsRNA,利用叶碟饲喂法将其导入朱砂叶螨体内,经qPCR检测TcGSTM7表达水平显著下调后,进行生物测定分析基因沉默后朱砂叶螨对不同剂量甲氰菊酯和丁氟螨酯药剂敏感性的变化。【结果】TcGSTM7的氨基酸序列分析结果表明,其N端具有一个Mu家族GST特有的"thioredoxin-like"结构域,以及一个GSH的结合位点(G-site),在C端则具有催化底物结合域(H-site)。该蛋白具有9个α螺旋和4个β折叠结构,呈经典的"βαβαββα"排列方式。在三维结构预测的基础上,通过原核表达技术获得了TcGSTM7重组蛋白,该重组蛋白分子量为26 kD,与预测结果一致,并且具有GST蛋白的催化活性。TcGSTM7重组蛋白酶活性为673.26nmol·min-1·mg~(-1),其动力学常数Km为0.71 mmol·L~(-1),Vmax为109.54 nmol·min-1·mg~(-1)。药剂抑制试验结果表明甲氰菊酯和丁氟螨酯均可抑制TcGSTM7重组蛋白的酶活性,IC_(50)分别为0.038和0.2 mmol·L~(-1)。进一步利用叶碟饲喂法让朱砂叶螨取食dsRNA,对TcGSTM7的表达进行了干扰,qPCR检测表明取食48 h后,dsRNA对TcGSTM7的干扰效率达到52.88%。药剂敏感性测定结果显示,沉默TcGSTM7的表达后,朱砂叶螨对LC_(30)和LC_(50)的甲氰菊酯敏感性分别上升了9.0%和12.3%,对LC_(30)和LC_(50)的丁氟螨酯敏感性分别上升了12.9%和11.0%,且均达到显著水平(P0.05)。【结论】TcGSTM7的表达可以影响朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性,且其重组蛋白和这两种药剂存在互作效应,表明TcGSTM7可能在朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯的代谢过程中具有重要作用。     

黄地老虎幼虫取食棉花根茎部对植株上部叶螨适合度的影响

【目的】研究黄地老虎幼虫取食棉花根茎部,对植株上部叶片上截形叶螨Tetranychus truncates、土耳其斯坦叶螨Tetranychus turkestani和敦煌叶螨Tetranychus dunhuangensis种群适合度的影响。【方法】以中棉所49为供试棉花品种,在室内比较分析健康棉花植株和被黄地老虎幼虫取食为害棉株上3种优势棉叶螨生长发育和繁殖的差异。【结果】黄地老虎幼虫取食棉花根茎部显著延长截形叶螨若螨发育历期,但对幼螨存活率、若螨存活率、幼螨发育历期、产卵前期、单雌有效产卵量和雌成螨寿命无明显影响。黄地老虎幼虫取食棉花植株显著降低土耳其斯坦叶螨的单雌有效产卵量,但对幼螨存活率、若螨存活率、幼螨发育历期、若螨发育历期、产卵前期和雌成螨寿命无明显影响。黄地老虎幼虫取食为害显著延长敦煌叶螨幼螨和若螨发育历期,但对幼螨存活率、若螨存活率、产卵前期、单雌有效产卵量和雌成螨寿命无明显影响。【结论】黄地老虎幼虫取食为害棉花根茎部对截形叶螨、土耳其斯坦叶螨和敦煌叶螨种群适合度的影响较小。     

不同猎物饲喂对南方小花蝽捕食量和喜好性的影响

为探讨南方小花蝽对不同猎物的捕食喜好性,室内用西花蓟马、蚕豆蚜、二斑叶螨、混合饲料(同时饲喂3种猎物)分别饲喂南方小花蝽驯化两代,研究了4种饲喂处理的南方小花蝽初孵若虫、5龄若虫和雌成虫对西花蓟马、蚕豆蚜和二斑叶螨的捕食量和喜好性.结果显示不同猎物饲喂处理驯化的南方小花蝽1龄若虫对同一种猎物的捕食量和喜好性均不存在显著差异.南方小花蝽5龄若虫和雌成虫对某种猎物的捕食量因前期取食的猎物种类不同而有显著差异.南方小花蝽5龄若虫和雌成虫均表现出对西花蓟马2龄若虫的正喜好性.蚕豆蚜饲喂处理的5龄若虫和雌成虫对蚕豆蚜表现出正喜好性,除二斑叶螨饲喂处理外其余3种处理的南方小花蝽5龄若虫和雌成虫均表现出对二斑叶螨的负喜好性.以上结果表明4种饲喂驯化处理的南方小花蝽1龄若虫的喜好性不受前期取食猎物的影响,但5龄若虫和雌成虫对前期取食过的猎物的喜好性增强,存在一定的学习行为.     

棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 k D,理论等电点为8.99,不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 k D,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1﹕409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性。【结论】利用3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用。