促黄体生成素和17β-雌二醇对牦牛输卵管糖蛋白表达的影响

为研究相关激素是否通过体细胞参与哺乳动物胚胎发育的调控,本研究探讨了促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)和17ββ-雌二醇(17β-estradiol,E2)对牦牛(Bos grunniens)输卵管上皮细胞分泌输卵管糖蛋白(oviductin,Ovn)的影响.体外培养牦牛输卵管上皮细胞,分别添加0、10、25、50、100和200 ng/mLLH和E2,作用72h后,运用qRT-PCR和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测Ovn表达.获得如下结果:(1)LH和E2可以提高牦牛输卵管上皮细胞的Ovn mRNA相对表达量;当LH浓度为10 ng/mL时,Ovn mRNA的相对表达量最高,显著高于LH浓度为25、50、100和200 ng/mL组(P＜0.05),对照组Ovn mRNA的表达量最低(P＜0.05);当E2浓度为25 ng/mL时,输卵管上皮细胞的Ovn mRNA相对表达量最高,显著高于E2浓度为10、50、100和200 ng/mL组(P＜0.05),对照组Ovn mRNA表达量最低(P＜0.05).(2)Ovn主要分布于核膜,细胞质也有表达;LH和E2可以提高输卵管上皮细胞的蛋白相对表达量,当LH浓度为10ng/mL时,Ovn的蛋白表达量达到最高,LH浓度达到25 ng/mL时,Ovn的蛋白表达量降低;当E2浓度为10～25 ng/mL时,Ovn的蛋白表达量随着E2浓度的上升不断增加,在25 ng/mL的E2作用后,Ovn的蛋白表达量达到最高,E2浓度达到50 ng/mL时,Ovn的蛋白表达量降低.上述结果表明,LH和E2对牦牛输卵管上皮细胞分泌Ovn具有明显的促进作用,LH的最佳作用浓度为10 ng/mL,E2的最佳作用浓度为25ng/mL.本研究为揭示LH和E2对输卵管上皮细胞分泌Ovn的作用机制提供了基础资料,为进一步研究相关激素对牦牛胚胎发育的调控提供了一定理论依据.     

鱿鱼墨黑色素提取物对肿瘤细胞的抑制作用

为探索鱿鱼墨黑色素提取物(SIME)对体外培养的肿瘤细胞的抑制效应,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法和划痕试验比较SIME对人结肠癌细胞HCT-116、宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞Hep G2、乳腺癌细胞MCF-7和前列腺癌细胞PC-3增殖及细胞迁移能力的影响。结果表明,SIME对肿瘤细胞形态有不同程度的影响,对肿瘤细胞增殖有浓度依赖性抑制作用,并具有抑制肿瘤细胞非定向迁移的作用。SIME对HCT-116和PC-3细胞增殖的抑制作用较好,72 h时两者半数抑制浓度IC50分别为0.144mg·m L~(-1)和0.485 mg·m L~(-1)。由此可见,SIME具有较强的抗肿瘤活性,该研究结果为鱿鱼墨高值化利用提供了一定的理论依据。     

朱砂七多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒作用研究

猪传染性胃肠炎(swine transmissble gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Swine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种高度传染性的猪病毒性疾病.为探讨朱砂七(Polygonum cillinerve)多糖对TGEV的体外抑制作用,本研究以猪(Sus scrofa)睾丸(swine testis,ST)细胞为实验材料,通过先加药后接毒、先接毒后加药及药物与病毒混合感作3种给药方式,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法MTT法)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同浓度的朱砂七多糖对TGEV在ST细胞的体外抗吸附、直接杀灭和抑制增殖作用.MTT法结果显示,朱砂七多糖对ST细胞的最大无毒浓度(TC0)为20 μg/mL;最大安全浓度(20 μg/mL)时,对TGEV的抗吸附作用最好,抑制率达85.2％;对体外增殖的抑制率达78.4％;直接灭活作用抑制率达74.4％,且抑制率与浓度呈正相关.qRT-PCR检测结果表明,朱砂七多糖在3种给药方式下均能在转录水平显著降低TGEVNmRNA相对表达量,与病毒对照组相比差异极显著(P＜0.01),并存在一定的剂量依赖性.研究结果表明,朱砂七多糖对TGEV在ST细胞上增殖有抑制作用,不同给药方式有所差异,其中以先加药后接毒给药方式的预防作用效果最佳.本研究初步证实了朱砂七多糖的体外抗TGEV作用,为朱砂七资源的开发和综合利用提供了依据.     

影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素

探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。     

国产丝裂霉素处理的STO细胞作为饲养层培养牛胚胎干细胞

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义.本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠(Mus musculus)成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据.用10、15、20、30和40 μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0 h的STO细胞;形态学观察不同代次STO细胞生长状态,并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色(AKP)、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4(OCT-4)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验.结果显示,当丝裂霉素的浓度为15 μg/mL处理3.0 h可有效的抑制细胞分裂;STO细胞在5～10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体.结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态,可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞.     

鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测

对含有鸡白细胞介素-18(ChIL-18)基因的质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)内进行诱导表达,经亲和层析法对表达产物进行纯化,用微量细胞病变抑制法CEF-VSV系统,检测其对SPF鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果;用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测其对T淋巴细胞诱导转化和NK细胞杀伤活性的作用。结果表明,经诱导表达出分子量44kD的目的蛋白(与GST融合表达),纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白;该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ,当浓度为250ng/mL时诱导IFN-γ的活性最高,可达1×106U/mL;但该蛋白不能直接抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长;能够刺激淋巴细胞显著增殖,浓度为250ng/mL时效果最佳;适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK细胞的杀伤活性,浓度为150ng/mL时,作用最强。利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白与天然鸡IL-18蛋白一样具有较广泛的生物学活性。     

肿瘤坏死因子-α诱导大鼠脂肪细胞凋亡

摘要：采用光学显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术3种技术，检测了不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对大鼠脂肪细胞凋亡的影响。结果表明，①TNF-α诱导脂肪细胞凋亡的形态学变化与浓度呈线性相关，在5~20 ng/mL范围内，浓度越大，凋亡特征越明显。②5 ng/mLTNF-α处理有明显的形态学变化，但电泳结果未见梯状条带，说明细胞凋亡的形态学变化早于细胞凋亡的生化特征性改变。③TNF-α诱导脂肪细胞凋亡在5~20 ng/mL浓度范围内存在剂量-效应关系，5，10，15和20 ng/mL TNF-α处理组与对照组相比差异极显著（P <0.01），10 ng/mL与15和20 ng/mL处理组之间差异不显著（P>0.05），以10 ng/mL为最佳诱导浓度。     

表皮生长因子（EGF）对牛前脂肪细胞增殖和分化的影响

以分离新生牛腹股沟白色脂肪组织的前脂肪细胞进行原代培养为基础,采用MTT比色法和油红O提取比色法研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响,同时通过半定量RT-PCR检测不同浓度EGF处理细胞第8天时对分化标志基因脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid-binding protein,A-FABP)mRNA表达的影响.结果表明,10 ng/mL EGF能极显著地促进前脂肪细胞的增殖(P<0.01),在分化诱导后添加不同浓度的EGF在第8天均可促进脂肪细胞的分化,并能促进脂肪细胞分化标志基因LPL、PPARγ和A-FABPmRNA的表达.EGF可以促进牛前脂肪细胞的增殖和分化.     

绵羊β2-肾上腺素能受体基因(β2-AR)的克隆及其第二细胞外环在大肠杆菌中的表达

本研究以β2-肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)基因的保守序列设计了1对PCR引物,通过PCR技术首次获得了萨福克、小尾寒羊和中国美利奴(新疆型)3个绵羊(Ovis aries)品种的β2-AR基因(GenBank登录号分别为EU707939、EU707940和EU707941),该基因含一个1 257 bp的开放阅读框(ORF),编码418个氨基酸残基.核苷酸序列分析显示,绵羊β2-AR基因与牛、猪、大鼠和人的相似性分别为98.4%、88.5%、84.2%和80.5%.通过基因合成技术合成了双拷贝的绵羊β2-AR第二细胞外环编码区DNA,并将其与pET32C(+)重组.重组菌以1 mmol/L IPTG诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析,绵羊β2-AR第二细胞外环融合蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,表达产物分子量约为26 kD,表达水平最高占菌体总蛋白的40.3%.     

祁白术多酚酶法提取工艺优化及其抗氧化、抑制黑色素合成活性

为考察祁白术多酚(polyphenols from Atractylodes macrocephala Koidz grown in Qimen, AMP)的可利用性,采用响应面分析法优化酶法提取工艺,并研究AMP的抗氧化、抑制黑色素合成活性。结果表明,在料液比1:30 g·mL^-1、酶解时间20 min的条件下,当纤维素酶添加量为1.35%、酶解温度为44℃、pH值为4.7、搅拌转速为670 r·min^-1时,AMP提取量最高,为26.58±0.23 mg·g^-1。统计学分析显示,所选响应面模型拟合较好,优化后的提取工艺条件合理可行。AMP具有较好的抗氧化活性,其总还原力、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除作用随其浓度的增加而增强。当AMP浓度为0~0.02 mg·mL^-1时,对B16细胞无毒性作用。与α-MSH模型组相比,AMP显著下调了细胞内酪氨酸酶活性(P<0.05),并呈浓度依赖性地抑制细胞内黑色素的合成(P<0.05);当AMP浓度为0.02 mg·mL^-1时,对细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成抑制率分别为30.11%、43.35%,阳性对照熊果苷(0.1 mg·mL^-1)对细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的抑制率分别为22.03%、39.77%,表明AMP对黑色素生成的抑制效果强于熊果苷。本研究结果为祁白术多酚的综合开发利用提供了依据。     

PHA-P及孕酮对孕早期山羊 子宫内膜γδ+T细胞体外分泌TGF-βS的影响

测定山羊孕早期子宫内膜γδ+T细胞体外分泌转化生长因子(TGF-β1及TGF-β2)水平,研究PHA-P及孕酮对该细胞体外分泌此二种细胞因子的影响.手术分离妊娠32 d莎能山羊子宫内膜,经胶原酶消化及淋巴细胞分离液离心制得子宫内膜淋巴细胞,采用免疫磁珠分离法(MACS)从中获得γδ+T细胞(1×106/mL),以RPMI1640+FCS完全培养液培养于96孔细胞培养板上,并向部分孔加入20 mg/mLPHA-P和10 ng/mL孕酮溶液作实验处理.体外分泌测定显示,(1)PHA-P极显著地(P＜0.01)促进妊娠32 d山羊子宫内膜yδ+T细胞分泌TGF-β1(42.550±4.789 ng/mL)及TGF-β2(4.2998±0.012 ng/mL).(2)生理水平孕酮能极显著抑制该γδ+T细胞分泌TGF-β1(3.533+1.914 ng/mL,P＜0.01),且能使TGF-β1的分泌保持在一定水平,但对TGF-β2分泌的抑制作用不显著(0.7931±0.009 ng/mL,P＞0.05),证明生理水平孕酮参与体内TGF-β1水平的下调和分泌维持,但可能不参与TGF-β2分泌活动的下调.(3)PHA-P处理、孕酮处理及γδ+T细胞对照的TGF-β1分泌水平均明显高于TGF-β2,证明γδ+T细胞是妊娠早期山羊母-胎界面TGF-β1的主要来源.     

促性腺激素及卵泡液协同对牛腔前卵泡体外发育的影响

将100个φ100～150μm牛腔前卵泡,随机分成8组,每组12～13个卵泡,在McCoy's 5a无血清培养系统研究了促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)有、无两种情况下,添加0、10%、15%及20%牛卵泡液(BFF)对牛腔前卵泡的体外生长、发育、存活及雌二醇(E2)分泌的影响.结果显示,在无促性腺激素下,添加不同浓度BFF对牛腔前卵泡体外发育无明显促进作用(P>0.05),但可刺激体外培养腔前卵泡的E2分泌.当有10 ng/mL LH和50 ng/mL FSH存在下,培养不同时间腔前卵泡的发育率、存活率,各卵泡液组均高于对照组,其中10%BFF组腔前卵泡培养6 d时发育率为(78.52%)与对照组(49.28%)差异显著(P<0.05),培养12 d腔前卵泡φ增长值33.7±4.8μm,显著高于对照组及其它处理组(P<0.01),同时在培养9 d时,有一枚卵泡成腔;各添加卵泡液组的E2测定值更高,其中添加10%BFF组中φ>100μm腔前卵泡在培养6 d时其E2分泌量达最高值48.96±1 1.54 pg/mL.表明FSH、LH存在下,培养液中加入10%BFF可显著提高腔前卵泡在体外的生长、发育、存活和E2分泌及诱导卵泡腔的形成.     

费菜黄酮对柑橘意大利青霉菌抑制作用的研究

为研究费菜黄酮对意大利青霉的抑菌效果并揭示其抑菌机制,本试验采用损伤接种法接种意大利青霉至柑橘,观察0、0.3、0.6、1.2 mg·mL^-1费菜黄酮对柑橘青霉病的控制效果,探究其对意大利青霉细胞膜通透性、细胞成分释放、菌丝表面结构、菌丝丙二醛(MDA)和过氧化氢(H₂O₂)含量等指标的影响。结果表明,费菜黄酮能够显著抑制菌丝生长,1.75 mg·mL^-1浓度下的抑制率为75.82%,7.00 mg·mL^-1 浓度下的抑制率达到100%。经费菜黄酮处理后,意大利青霉细胞膜通透性显著增加,糖类等胞内物质释放至细胞外;扫描电镜显示菌丝体结构遭到破坏,菌丝体表面出现褶皱、塌陷;同时引起H₂O₂和MDA含量增加;柑橘果实的发病率和病斑直径减小。本研究结果为天然杀菌剂的研制以及抑菌机制的后续研究提供了一定的理论依据。     

大菱鲆心脏细胞系的建立与鉴定

为丰富海水鱼类细胞系的数量,提供更多的基因功能研究及病毒分离、鉴定工具,本研究建立了一种新的细胞系,大菱鲆心脏细胞系(Scophthalmus maximus heart cell line,SMH).该细胞系使用组织块法(tissue block method)启动原代培养,培养液是添加了胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、人类碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、抗生素、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)的DMEM/F 12.结果显示,SMH形态呈典型的成纤维细胞样,在培养液中生长分裂旺盛,经230 d传代培养,成功传至58代.用带有绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)的pEGFP-N3质粒转染SMH,发现GFP在细胞中成功表达,转染效率为40％左右.使用遗传霉素(geneticin,G418)对重组质粒细胞进行筛选,得到了一簇荧光表达效率高的细胞.染色体分析表明,具有正常二倍体核型(2n=44)的细胞占64％.线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase sub-unit Ⅰ,CO Ⅰ)基因鉴定出该细胞系来源于大菱鲆.该细胞系的建立为大菱鲆功能基因及其他基于细胞系的研究奠定了基础,对大菱鲆的病毒感染途径和分子机制研究具有重要的理论意义.     

羊栖菜组分多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

为高效利用羊栖菜组分多糖(SFPSⅠ),以SFPSⅠ为原料,α-葡萄糖苷酶作为靶标,研究SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其结构的影响,建立具有α-葡萄糖苷酶活性的Caco-2细胞模型,并对Caco-2细胞模型上α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果进行研究。结果表明,SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用,使得α-葡萄糖苷酶活力下降一半时的抑制剂浓度,即半抑制(IC₅₀)为0.31 mg·mL^-1。SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一个可逆过程,抑制类型为混合型抑制。动力学分析结果表明,SFPSⅠ对α-葡萄糖苷酶的抑制常数(K_i)为0.143μmol·L^-1。荧光测定结果表明,SFPSⅠ结合会引起α-葡萄糖苷酶三级结构的明显变化。随着SFPSⅠ浓度的升高,其对Caco-2细胞模型上α-葡萄糖苷酶抑制效果越好。本研究结果为进一步探讨和设计新型α-葡萄糖苷酶抑制剂奠定了科学基础,同时也为开发具有降血糖功能的功能性药品与保健品提供了新资源。     

脱羰秋水仙碱诱导牛卵母细胞显核

用脱羰秋水仙碱(deme colcme,Deme)诱导牛卵母细胞显核.比较不同显核时间、Deme浓度以及极体形成等因素对牛卵母细胞显核的影响.结果显示:①0.5μg/mL Deme处理卵母细胞,诱导1 h时获得最高显核率(76.00%),高于0.5 h(61.18%)、1.5 h(64.10%)和2 h(63.46%)组;②不同浓度Deme处理成熟卵母细胞1 h,0.4和0.5μg/mL Deme组显核率较高,分别为75.24%和77.31%,显著高于0.3 μg/mL组(46.54%)与0.6 μg/mL(60.66%)组;③0.4 μg/mL Deme处理卵母细胞1 h,有极体组显核率(83.24%)与无极体组(77.54%)无显著性差异.研究表明,0.4 μg/mL Deme处理卵母细胞1 h能更好地诱导牛卵母细胞显核.     

重离子束辐照、激素FSH/LH及丙酮酸钠对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

研究不同剂量重离子束辐照、FSH与LH的配比及添加不同浓度丙酮酸钠对绵羊卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)的影响.结果显示1.0和1.5Gy辐照可以明显提高绵羊卵母细胞ⅣM;成熟液中添加10μg/ml FSH与10μg/ml LH(1:1,即Ⅱ组)时其IVM最高,显著高于Ⅰ组(1:2)、...     

pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化

绿色荧光蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记,将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y染色体上是利用GFP分选X和Y精子的关键.本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和Lox2272位点引入pEGFP-N3载体中,构建了重组质粒pEGFP-loxp-Lox2272.采用LipofectamineTM (Lip)2000介导线性化质粒p EGFP-loxp-Lox22 72转染牛胎儿成纤维细胞,结果显示,在质粒用量一定的情况下30μL Lip 2000转染细胞的效果最理想;转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418筛选,结果显示,浓度为600μg/mL的G418最适合筛选转基因细胞.本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考.     

牛磺酸、谷酰胺、改良CR1和改良CR2培养液对牛受精卵体外发育的影响

本研究探讨了牛磺酸、谷酰胺、改良CR1 (CR1 无机盐成分 10% 胎牛血清) 和改良CR2 培养液(改良CR1 液 1 m m ol/L谷酰胺和绵羊输卵管分泌液浓度的多种氨基酸)对牛卵子体外受精后的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。结果表明: 牛磺酸和谷酰胺对牛卵子受精后体外发育的影响依赖于胚胎培养液种类; 利用改良CR1 和改良CR2 培养液可成功生产可移植胚胎, 但它们所生产的可移植胚胎的效率无显著差异, 利用改良CR1 培养液生产可移植胚胎的成本更低一些。