桑树内生真菌Macrophomina phaseolina MOD-1原生质体制备条件的优化试验

为了应用原生质体技术改良桑树内生产油真菌Macrophomina phaseolina MOD-1的产油性能,对影响MOD-1原生质体制备的酶液组分、菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类等因素进行优化。通过正交试验得到最佳酶液组合为:20mg/mL纤维素酶+20 mg/mL溶菌酶+5 mg/mL蜗牛酶。在此基础上应用响应面分析法获得影响MOD-1原生质体产量的显著因素有菌龄和渗透压稳定剂浓度,且均产生负效应。以此作为中心点进一步优化原生质体制备条件为:培养44.58 h的MOD-1菌丝,用0.66 mol/L KCl作渗透压稳定剂,30℃条件下酶解4 h。在此优化条件下,获得的MOD-1菌株原生质体产量可达7.06×106个/mL,优化条件具有实用价值。     

大肠杆菌菌苗的研制

对苗用菌株的灭活时间和菌苗免疫条件进行筛选的条件下,用甘肃省大肠杆菌的代表血清型和筛选的大肠杆菌原生质体融合菌株研制大肠杆菌菌苗,并进行菌苗安全性试验。正交试验试验结果表明:菌苗的最佳组合是抗原含量是4亿/mL和佐剂含量是10 mg/mL。苗用菌株的灭活试验结果表明:鸡苗的灭活条件是1%甲醛作用96 h;猪苗的灭活条件是2%甲醛作用48 h。     

桑树内生真菌Macrophomina phaseolina MOD-1产油脂培养基及摇瓶发酵条件的优化试验

从健康桑树根系中分离筛选得到一株内生产油脂真菌——菜豆壳球孢菌MOD-1(Macrophomina phaseolina,MOD-1)。结合均匀设计和单因子筛选法得到该菌株产油脂发酵培养基最优配方为:可溶性淀粉105 g/L,蛋白胨1.1 g/L,磷酸二氢钾1.5 g/L,硫酸铵0.3 g/L,硫酸镁0.32 g/L,氯化锰4.9 nmol/L。在此基础上优化该菌株产油脂的摇瓶发酵条件为:发酵液初始pH7.0,发酵温度26℃,摇瓶转速190 r/min,装液量100 mL。在优化后的培养基组分及摇瓶发酵条件下培养6 d,菌体生长量(干质量)高达41.852 g/L,油脂产量达到25.511 g/L。利用气相色谱-质谱法分别测定菌株在优化后的培养基或发酵条件下产生油脂的脂肪酸组成,前一种条件下检测出9种脂肪酸成分,其中单不饱和脂肪酸含量为67.92%;后一种条件下检测出7种脂肪酸成分,其中单不饱和脂肪酸含量为74.32%。结果表明,在优化培养基及摇瓶发酵条件下,MOD-1菌株的油脂产量增高,组成简单,易于纯化,且单不饱和脂肪酸含量较高。     

表达Omp1和Omp2的猪大肠埃希菌融合菌株R2的构建

为了构建猪大肠埃希菌融合菌株,在药敏试验和MIC试验的基础上,对猪大肠埃希菌HY2株(O101,Omp1)和GXA1株(O107,Omp2)进行交叉耐药培育.以HY2(O101,Omp1,Amir,Czls)和GXA1(O107,Omp2,Czlr,Amis)为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备两亲本菌株原生质体,通过聚乙二醇(PEG)助融,进行原生质体融合,得到3株双耐药融合菌株.结果表明,猪大肠埃希菌原生质体制备和再生的最适条件是:溶菌酶浓度为200 U/mL,作用时间为25 min.筛选得到3株融合菌株R1、R2、R3,均可凝集两亲本的O抗原,其中,R2凝集性更好更稳定.进一步结合SDS-PAGE分析,显示融合菌株R2能较好的表达两亲本菌株形状,经多次传代仍能够稳定遗传.     

糙皮侧耳与酿酒酵母原生质体电融合条件的研究

为构建兼取木质素降解能力强和生长速度快的新型菌株,以糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体为亲本,采用双亲灭活标记方法,通过L16(45)正交试验研究交变电压、交变电场频率、脉冲场强、脉冲个数和脉冲间隔对两亲本电融合率的影响,利用拮抗试验和菌丝形态学比较方法对再生菌株进行筛选,RAPD分子标记方法对疑似融合株进行鉴定。结果表明:糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的最佳融合条件为交变电压30 V,交变电场频率1100 k Hz,脉冲场强6 k V/cm,脉冲次数4个,脉冲间隔10μs,融合率达到4.396×10-5。筛选出的3株疑似融合株均为亲本原生质体融合产物。     

产脂肪酶黑曲霉原生质体NTG诱变研究

以黑曲霉Aspergillus niger G27为初始菌株,制备原生质体。用亚硝基胍(NTG)对所制备的原生质体进行诱变,考察诱变效果。收集斜面菌丝体,经复合酶处理制备原生质体,分别于1×10-3mmol/m L NTG溶液中诱变处理0~60 min,考察菌株的死亡率、菌落变异率和产脂肪酶活性等。结果表明,原生质体再生率为7.5%。随着诱变时间增加,原生质体诱变死亡率、菌落变异率增加,并逐渐趋于稳定。初筛结果为随着诱变时间增加,脂肪酶活性标平均值降低,标准偏差值增加,变异系数值增加。NTG诱变时间为20~40 min时,出现比较多的正变菌株。经过复筛和验证试验,得到P316菌株脂肪酶活性为(394.3±12.9)U/m L,比出发菌株发酵酶活高22.9%;P388菌株为(385.1±11.4)U/m L,比出发菌株发酵酶活高20.1%。可见采用NTG诱变菌株的原生质体获得良好的诱变效果,结合筛选获得了2株遗传稳定的高产突变菌株。     

大肠杆菌 K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗菌株培养条件的优化

试验使用发酵罐对大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B三价基因工程疫苗菌株进行培养,从培养基、通气量、诱导剂以及诱导条件4个方面进行研究,根据该工程疫苗菌株的特性进行灭活试验研究。结果表明,改良LB培养基为该菌株的最适培养基,诱导剂乳糖100 mmol/L、诱导6 h以上,可以达到经济效益的最大化;在20万mL发酵罐中培养K88ac-ST_1-LT_B重组菌株的最适宜通气量为500 L/min。灭活试验结果显示,在37℃条件下,加入0.4%甲醛溶液搅动、灭活48 h,灭活效果较为彻底。     

仔猪副伤寒活疫苗生产用菌株生长曲线的建立及合成培养基初步应用

建立了仔猪副伤寒活疫苗生产用菌株生长曲线,获取菌株培养参数,从而实现合成培养基初步应用。将猪霍乱沙门氏菌(CVCC79500株)运用试管和三角瓶分别静置和振荡培养30 h,期间取4、8、12、18、24、30 h等6个点进行活菌计数并建立生长曲线,确定37℃静置培养18~24 h,37℃、200 r/min振荡培养8~24 h为培养稳定期。不同接菌量比较结果表明,37℃静置培养24 h,37℃、200 r/min振荡培养12 h均可达到菌体稳定期。在稳定期参数条件下,比较合成培养基与常规普通肉汤培养基对该菌的增殖效果,结果表明,37℃静置培养24 h,试管及三角瓶培养菌数分别为27×108~31×108、33×108~41×108CFU/m L;37℃、200 r/min振荡培养12 h,试管及三角瓶培养菌数分别为58×108~66×108、78×108~88×108CFU/m L。而同条件3批普通肉汤培养菌数均低于合成培养基,且批次间稳定性较合成培养基差。将合成培养基振荡培养12 h的菌液接种小鼠均10/10存活;免疫后攻毒家兔达4/5~5/5保护,与普通肉汤基本一致。合成培养基保存期试验表明,25℃避光保存28 d与当天配制的液体合成培养基,振荡培养菌数基本一致。获取的培养参数适合用于合成培养基的初步评价,研制的合成培养基培养菌数优于普通肉汤,且不影响菌体安全性及免疫原性,室温保存期可达28 d。     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Ww1株(O78,OMP-3,AmpR,KS)和WD2株(O2,OMP-1,AmpS,KR)作为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体,以PEG作为助溶剂,进行原生质体融合,得到4株双耐药融合菌株,融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性,且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3,OMP-1)和O抗原(O78,O2),表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

糙皮侧耳原生质体与酿酒酵母原生质体最佳融合条件的研究

以糙皮侧耳和酿酒酵母为材料,采用正交设计和双灭活标记方法研究融合时间、融合温度、p H、Ca2+浓度和聚乙二醇质量浓度对糙皮侧耳原生质体与酿酒酵母原生质体融合率的影响。结果表明:糙皮侧耳原生质体和酿酒酵母原生质体的最佳融合条件为质量浓度35%聚乙二醇(PEG 4 000)与0.06 mol/L Ca2+的混合溶液(p H11)作为促融剂,在30℃条件下融合20 min,融合率达到2.609‰。     

草地早熟禾种间原生质体电融合条件的研究

为改良培育草地早熟禾(Poa pratensis)新品种,拟建立草地早熟禾商用品种与具有优良性状的野生早地早熟禾种间原生质体融合体系。采用电融合法,研究了电融合仪的电场条件和原生质体密度对草地早熟禾种间原生质体融合的影响。结果表明:在交流电场强度和频率分别为20 V/cm和2000k Hz时,原生质体可在较短的时间内形成2~4个原生质体串;最适于草地早熟禾种间原生质体融合的直流脉冲强度为200 V/cm、DC幅宽为40μs、直流脉冲次数为3次,原生质体密度为3×105个/m L,在此条件下,草地早熟禾种间原生质体总融合率和一对一融合率可分别达到25.39%和12.27%。     

鸭疫里默杆菌与大肠杆菌融合株的构建

对鸭疫里默杆菌（YL1）和大肠杆菌（ZYD2）原生质体的制备、再生、融合条件进行优化,成功获得了64株具有双亲菌株耐药性,能够同时凝集兔抗ZYD2血清和兔抗YL1血清,且能够稳定遗传的融合菌株;通过培养特性、菌落特征、融合菌株形态染色特性、生化试验等鉴定,筛选出4株典型融合菌株DL4、DL5、DL8、DL29。攻毒试验表明,ZYD2的半数致死量为1.5×107,YL1的半数致死量为5.0×107,4株典型融合菌株的半数致死量分别为2.8×108、1.7×108、1.0×109、4.4×109,融合菌株毒性比亲本菌株毒性减弱。免疫保护试验和免疫鸭抗体水平测定结果证实,融合菌株具有良好免疫原性。     

致病性大肠杆菌苗用菌株的原生质体融合的研究

对筛选的5株大肠杆菌(E2:O2、E6:O78、E7:O8、E9:O9、E22:O138)进行药敏试验以及致病性大肠杆菌原生质的制备、融合和筛选试验。结果表明:①5株大肠杆菌对多种抗菌素存在抗药性,并且这种抗药性能进行培育,同时,在原生质的融合过程中能递进;②大肠杆菌原生质体选择的最佳组合是:溶菌酶2.0 g/L,处理时间是20 m in;③大肠杆菌的融合率在10-8左右,大肠杆菌之间的融合率为10-6左右;共选出3株融合菌株为E2-E6、E6-E7和E2-E22,各融合株的生化特征介于起源菌株的生化特征之间,有2株融合株的抗原特征含原菌株各自的抗原成分。     

亚成体大熊猫病原菌EL-1和EL-2株毒力及菌苗免疫剂量的测定

以亚成体大熊猫病原菌EL-1和EL-2菌株注射实验动物小白鼠（KM）,测定其半数致死量,其中EL-1菌株LD50为2.75×10~8CFU/只,EL-2菌株LD50为4.03×10~8CFU/只,两菌制成灭活菌苗按一定的浓度梯度注射实验动物家兔,其最佳的免疫剂量为1×10~8CFU/只家兔。     

应用CCK8法检测鸡淋巴细胞活性的检测最佳条件研究

为了研究应用CCK-8法检测鸡淋巴细胞增殖的体外培养最佳条件,试验设置了不同种板细胞数、血清浓度、培养时间、孵育时间和检测波长等条件对其进行比较研究。结果表明:1 750 r/min转速的改良鸡外周血淋巴细胞分离方法效果最佳;在体外增殖培养试验中,CCK-8加样4 h后在450 nm波长处检测OD值最理想,培养时间以44 h为最佳;在细胞数量一致的情况下,胎牛血清浓度为5%或者为10%差异不显著(P0.05)。当细胞悬液浓度为1×10~6个/m L时,加入100,50,25,12.5μL不同细胞数,4组间比较均差异显著(P0.05),并且随着细胞悬液浓度的增加OD值增加;最佳铺板细胞的细胞悬液浓度为2.0×10~6~3.0×10~6个/m L,取50~100μL为宜,即最佳细胞铺板数量控制在每孔1.5×10~5~2.0×10~5个/100μL。说明应用CCK-8法检测鸡外周血淋巴细胞活性的最佳条件除种板细胞数不同外,在检测波长、血清浓度、加样后孵化时间等方面与其他动物试验差别不大。     

匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合研究

以匍匐翦股颖克罗米和狗牙根新农1号为材料,通过愈伤诱导、继代和悬浮培养,进而细胞融合来探讨草坪草品种改良的新方法.结果表明:(1)匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合时酶解液的最佳组合为:1.5%纤维素酶、0.1%果胶酶、0.7M甘露醇,10h酶解时间,且酶解前应用高渗溶液预处理效果更佳;(2)细胞融合时,原生质体密度2×106个/mL,融合剂由30%的PEG4000、15mmol/L CaCl2·2H2O、0.5mmol/L KH2PO4·H2O、0.5mol/L甘露醇组成,并调pH至7.5效果较好;(3)匍匐翦股颖和狗牙根细胞PEG融合率约为5%,以30min融合时间效果较好,产生的多核融合体少,杂种细胞多呈条形,具有较强的活力.     

一株枯草芽孢杆菌的鉴定及液体发酵工艺优化

从鸡肠道筛选出一株菌,命名为DY032,经16S r DNA分子鉴定和系统发育分析,该菌种为枯草芽孢杆菌。在摇瓶发酵条件下,采用单因素试验,对菌株DY032的培养基配方进行优化,确定了影响发酵液菌体数和芽孢数的5个因素,分别为淀粉、鱼粉、豆饼粉、MnSO_4·H_2O和CaCO_3,其适宜浓度分别为20、10、10、0.05、0.05 g/L,进一步通过L_(16)(4~5)正交试验确定以上5因素的最佳配比。为放大培养,在最优培养基基础上,利用10 L发酵罐,采用L_9(3~4)正交试验设计,以芽孢数为指标,对菌株DY032的培养温度、pH值、搅拌转速、通气量4个条件进行优化。结果表明:菌株DY032培养基最优配方为:淀粉16 g/L,鱼粉10 g/L,豆饼粉10 g/L,Mn SO4·H2O 0.05 g/L,Ca CO30.03 g/L。最优发酵罐培养条件为:培养温度37℃,pH值6.5,转速200 r/min,通气量5 L/min,最终芽孢数可达51.95×108cfu/m L。     

1株锦鲤致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病锦鲤体内分离得到1株细菌ML1,经人工感染后发现ML1具有较高的致病性,临床症状与自然发病症状一致,96 h的LD50为5.0×107cfu/m L。ML1菌株革兰染色呈阴性,杆状。16S rRNA基因序列分析结果显示,序列片段长度为1 419 bp,ML1菌株在系统发育树上与嗜水气单胞菌聚类,相似性达到100%。综合VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪的生理生化特征分析、形态学观察、人工感染以及16S rRNA基因序列分析,将ML1菌株鉴定为嗜水气单胞菌。ML1菌株的最适生长p H为7~9,最适生长温度为28℃。在28℃200 r/min条件下的生长周期是:0~4 h为生长延迟期,4~10 h为对数生长期,10~24 h为稳定期,24~48 h为衰亡期。药敏试验表明,ML1菌株对多黏霉素B、环丙沙星、诺氟沙星等高度敏感,对磺胺异恶唑中度敏感,对麦迪霉素、氨苄西林、林可霉素等不敏感。研究结果为指导临床合理用药提供了科学依据。     

原生质体融合技术筛选高产虾青素酵母菌株

采用原生质体融合技术,以红发夫酵母突变株和黏红酵母突变株为亲本菌株,以原生质体形成率和再生率的乘积为检测指标,对菌株菌龄、酶解温度、酶解时间和渗透压稳定剂等原生质体形成和再生的条件进行研究。结果表明,处于对数生长前期的红发夫酵母和处于对数生长中期的黏红酵母原生质体形成率和再生率的乘积显著高于其他组(P<0.05);红发夫酵母原生质体形成率和再生率的乘积在酶解温度22 ℃时为17.34%,在25和28 ℃时为0,黏红酵母形成率和再生率的乘积在22和25 ℃时显著高于28 ℃(P<0.05),但2个温度之间差异不显著(P>0.05);2菌株原生质体形成率和再生率的乘积在酶解时间为2 h时显著高于其他组(P<0.05);对照组渗透压稳定剂的组合对原生质体形成率和再生率的乘积显著高于其他组(P<0.05)。红发夫酵母和黏红酵母原生质体形成和再生的最适条件为:红发夫酵母菌龄为14 h、黏红酵母菌龄为18 h、酶解温度均为22 ℃、酶解时间均为2 h,原生质体形成的最适渗透压稳定剂均为1.0 mol/L的KCl缓冲液,再生的最适渗透压稳定剂均为17%蔗糖稀释液;最后筛选出1株能在28 ℃生长良好且虾青素含量586.38 μg/g的融合子,比融合前红发夫酵母和黏红酵母分别提高了79.58%和64.08%,且传代多次生产性能稳定。     

鸡大肠杆菌多价灭活苗的研制及应用

用分离的鸡大肠杆菌地方致病菌株与大肠杆菌标准菌株制备细菌悬液,细菌含量大于1.8×1010 个/mL,用 4 mL/L 浓度的甲醛溶液作用12 h,灭活后加入佐剂,制备鸡大肠杆菌多价灭活苗,免疫接种 10 日龄健康雏鸡,15 d后进行攻毒试验。结果表明,鸡大肠杆菌多价灭活苗的保护率可达98%。田间应用,鸡群产蛋期月死淘率由 1.5%~3%下降到0.5%~0.8%。