应用原生质体融合技术构建纤维素发酵产油脂菌株的试验

原生质体融合(protoplast fusion)技术是将遗传性状不同的亲本原生质体融合杂交的基因重组技术。从健康桑树根系中分离到一株产油脂内生真菌MOD-1,采用酶解方法制备内生真菌MOD-1和产纤维素酶菌株绿色木霉TP4、T44及长柄木霉TL的原生质体,获得4个菌株的原生质体产量分别为7.02×10~6个/m L、4.43×10~6个/m L、6.35×10~6个/m L和4.35×10~6个/m L,再生率分别为4.90%、3.26%、4.51%和4.12%。优化亲本原生质体灭活条件为:MOD-1菌株经紫外线照射10 min或加热15 min,TP4菌株经紫外线照射25 min或加热20 min,T44菌株经紫外线照射25 min或加热25 min,TL菌株经紫外线照射30 min或加热25 min。在上述条件下各亲本原生质体的灭活率均达到100%。将灭活的MOD-1菌株原生质体分别与不同方式灭活的TP4、T44、TL菌株原生质体融合,经初筛和复筛获得了一株兼具MOD-1与TP4双亲优良性状的融合菌株MP-1,其油脂产量、油脂含量(质量分数)分别为0.082 4 g/L、14.46%,显著高于亲本菌株MOD-1。融合菌株MP-1传代培养10代后,油脂产量与油脂含量的遗传稳定性分别达到92.84%和95.00%。     

饲用枯草芽孢杆菌高产芽孢工艺优化及菌剂制备

为提高枯草芽孢杆菌SR096发酵液中芽孢含量,本研究通过单因素试验和响应面法试验对SR096发酵培养基中的碳源、氮源以及无机盐体系等组分进行了优化。最终确定发酵培养基组成为:葡萄糖7.5 g/L、玉米粉12.69 g/L、酵母粉10.66 g/L、黄豆粉20 g/L、柠檬酸钠4.46 g/L、碳酸钙1.5 g/L、硫酸镁2 g/L,优化后的发酵培养基在37℃、180 r/min条件下摇瓶培养48 h,枯草芽孢杆菌SR096菌株发酵液中芽孢含量可达7.978×10~9 cfu/mL,制备的益生菌剂具有耐热、耐酸、耐胆盐的优点并能在常温下长期贮存。     

青贮用黄曲霉毒素降解菌株的产芽胞条件优化

[目的]利用正交试验设计对青贮用黄曲霉毒素降解菌株N-1a产芽胞条件进行优化。[方法]以菌株的菌体生物量和芽胞形成率作为考察指标,利用单因素试验和正交试验设计优化菌株N-1a的发酵用培养基组成和培养条件。[结果]优化后的N-1a最佳产芽胞培养基组成配比为：玉米粉2.0%,黄豆饼粉1.0%,MnSO4·H2O 0.10%,MgSO4·5H2O 0.01%;最佳产芽胞条件为：p H值为7.0,发酵时间48 h,接种量4%,装液量75 m L/250 m L培养基;在该条件下,N-1a的菌体生物量为6.08×10^8cfu/m L,芽胞形成率为81.25%。[结论]菌株N-1a的摇瓶产芽胞条件为其中试生产提供了实验依据。     

枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的发酵工艺优化及培养基筛选的研究

研究旨在探索枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的最适发酵条件和最适培养基组成,以期提高发酵液中sublancin含量。试验先通过单因素试验筛选出最适发酵条件,确定发酵培养基需要的无机盐、碳源、氮源,再通过正交试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计的响应面分析方法确定最适发酵培养基组成。结果表明：枯草芽孢杆菌YT168-6产抗菌肽sublancin的最适发酵条件为菌种接种量1.0%、发酵温度37℃、发酵液初始pH 7.0;最适发酵培养基为K₂HPO₄ 5 g/L、KH₂PO₄ 5 g/L、MgSO₄ 10 g/L、可溶性淀粉30.2 g/L、蛋白胨23.6 g/L、玉米浆18.2 g/L;优化后sublancin产量由756 μg/mL提到1 581 μg/mL,是优化前的2.09倍。综上所述,本研究所筛选的最适发酵条件和最适培养基可为枯草芽孢杆菌YT168-6菌株工业化生产sublancin提供技术参考。     

一株枯草芽孢杆菌产抗菌肽培养基筛选及发酵工艺优化的研究

试验旨在对一株产抗菌肽枯草芽孢杆菌BL0006的发酵培养基和发酵条件进行优化,以提高发酵液中抗菌肽的效价。首先通过单因子试验筛选出培养基的最适碳源、氮源与无机盐分别为葡萄糖、蛋白胨和K_2HPO_4;在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法得到培养基最佳配方:通过摇瓶单因素试验对发酵条件、温度、接种量、转速进行了优化,优化后的发酵培养基为葡萄糖47.7 g/L、蛋白胨29.0 g/L、K_2HPO_4 3.3 g/L,摇瓶发酵工艺为接种量30 mL/L、初始pH 7.5、摇床转速220 r/min、培养温度37℃。优化后抗菌肽的效价提高到了4.25×10~4 U/mL,是优化前的3.51倍。综合试验结果,本研究筛选的培养基和优化后的发酵工艺可达到高产、降低成本、缩短发酵时间的效果。     

用脱脂蚕蛹水解物作氮源培养裂殖壶菌生产DHA的发酵工艺及动力学研究

二十二碳六烯酸(DHA)是人体生长发育所必需的一种多不饱和脂肪酸,裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)因高产富含DHA的油脂而被用于人工发酵生产DHA。为了降低DHA的生产成本,以脱脂蚕蛹水解物作为裂殖壶菌SR21菌株发酵培养基的唯一氮源,并对发酵工艺条件进行优化。以3 L发酵罐培养裂殖壶菌SR21菌株,当脱脂蚕蛹水解物用量为20 g/L、培养温度为26℃、初始p H为6.0、海水晶质量浓度为40 g/L和溶氧量为20%时,菌株发酵培养120 h获得的生物量为39.27g/L,油脂产量22.44 g/L,其中DHA生产效率为62.63 mg/(L·h)。与使用商品化酵母浸粉为培养基氮源相比,以脱脂蚕蛹水解物为氮源培养裂殖壶菌SR21菌株所产油脂的脂肪酸组成保持不变,且DHA产量高达7.52 g/L。利用Logistic模型和LuedekingPiret模型(R~20.99)成功拟合了裂殖壶菌在脱脂蚕蛹水解物作氮源的培养基中生长的动态过程,为后续分批补料培养提供了依据。研究结果表明,脱脂蚕蛹水解物适合作为有机氮源用于培养裂殖壶菌类微藻发酵生产DHA等高附加值油脂。     

一株枯草芽孢杆菌产抗菌肽培养基筛选及发酵工艺优化的研究

试验旨在对一株产抗菌肽枯草芽孢杆菌BL0006的发酵培养基和发酵条件进行优化,以提高发酵液中抗菌肽的效价。首先通过单因子试验筛选出培养基的最适碳源、氮源与无机盐分别为葡萄糖、蛋白胨和K_2HPO_4;在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法得到培养基最佳配方:通过摇瓶单因素试验对发酵条件、温度、接种量、转速进行了优化,优化后的发酵培养基为葡萄糖47.7 g/L、蛋白胨29.0 g/L、K_2HPO_4 3.3 g/L,摇瓶发酵工艺为接种量30 mL/L、初始pH 7.5、摇床转速220 r/min、培养温度37℃。优化后抗菌肽的效价提高到了4.25×10~4 U/mL,是优化前的3.51倍。综合试验结果,本研究筛选的培养基和优化后的发酵工艺可达到高产、降低成本、缩短发酵时间的效果。     

乳酸片球菌ZPA017发酵合成γ-氨基丁酸的条件优化

为提高乳酸片球菌ZPA017的γ-氨基丁酸(GABA)产量,本试验通过单因素筛选和响应面法,对其发酵培养基和培养条件进行了优化。结果表明:乳酸片球菌ZPA017产GABA的最佳培养基配方为:D-果糖18g/L、大豆蛋白胨40g/L、乙酸钠3g/L、磷酸氢二钾1.37g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、硫酸镁0.63g/L、硫酸锰0.29g/L、吐温-801mL/L。在此基础上,采用单因素筛选的方法,优化得到乳酸片球菌ZPA017产GABA的最佳发酵条件为:温度37℃、初始pH6.5、接种比例1%、发酵时间30h。乳酸片球菌ZPA017在最佳培养基和发酵条件下培养,发酵液中γ-氨基丁酸的含量达1.036g/L,是优化前产量的3.77倍。     

解淀粉芽胞杆菌固态发酵当归培养基的研究

为筛选和优化解淀粉芽胞杆菌固态发酵当归培养基,以当归多糖含量为指标,采用单因素试验对当归固态发酵培养基成分筛选,采用响应面分析试验对培养基组分进行优化。结果显示,在所筛选成分中,最适宜菌株发酵的固态培养基成分为当归、黄豆粉、碳酸钙和水。优化的固态发酵培养基各组分含量分别为:当归320.914 g/L、黄豆粉109.918 g/L、碳酸钙1.532 g/L、水544.159 mL/L,37℃发酵培养72 h,固态发酵物中的多糖质量分数达24.91 mg/g。结果表明,优化的当归固态发酵培养基适宜解淀粉芽胞杆菌生长,易于多糖的释放,所筛选的发酵培养基原材料符合固态发酵产业化生产条件要求。     

枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

采用单因素及正交实验法对枯草芽孢杆菌的培养基在摇瓶中进行优化,优化后的培养基为葡萄糖15g/L、酵母浸出物5g/L和MgSO45g/L;并通过单因素实验法确定了最佳培养条件为温度35℃,初始pH6.0,接种量3%,装液量20mL/250mL,发酵时间12h。     

吸水链霉菌BS-112菌株产生抗家蚕病原真菌活性物质的发酵培养基配方优化

为了开发利用吸水链霉菌BS-112菌株产生的抗真菌活性物质防治家蚕真菌病,在单因素试验基础上通过正交试验优化BS-112菌株分泌产生抗真菌活性物质的发酵培养基配方。优化后的最佳发酵培养基配方为:18.0g/L葡萄糖,12.0g/L玉米粉,35.0g/L黄豆饼粉,0.4g/LKH2PO4,0.8g/LMgSO4。优化发酵培养基配方后的菌株发酵液对家蚕病原绿僵菌的抗菌效价达到4916.85μg/mL,较基础培养基提高了3.08倍。分别以价格低廉的玉米粉和豆饼粉作为发酵培养基的缓效碳源和有机氮源,有利于该菌株在蚕用抗生素产业化开发的应用。     

Lactobacillus fermentum F6的增殖培养基优化及高密度发酵的研究

对分离自少数民族传统乳制品中的Lactobacillus fermentum F6菌种的增殖培养基进行优化,并对其高密度发酵条件进行探索。通过测定不同组成培养基中菌体在600nm波长下的光密度和发酵液在不同发酵条件下的活菌数,得到最适增殖培养基配方及其高密度发酵条件。增殖培养基配方为:蔗糖62.0g/L、酵母粉35.5g/L、大豆蛋白胨12.0g/L、柠檬酸1.35g/L、柠檬酸钠22g/L、MgSO4·7H2O2g/L、MnSO4·5H2O100mg/L、Tween-801g/L。在5L发酵罐中,Lactobacillus fermentum F6经优化发酵条件,其活菌数可达到2.30×1010CFU/mL,加入保护剂经冷冻干燥后活菌数可达到1.45×1011CFU/g,存活率为79.11%。中试培养液中活菌数可达1.02×1010CFU/mL,存活率为58%。以上优化的增殖培养基和高密度发酵条件为Lactobacillus fermentum F6的工业化生产奠定了基础。     

桑树内生真菌Macrophomina phaseolina MOD-1原生质体制备条件的优化试验

为了应用原生质体技术改良桑树内生产油真菌Macrophomina phaseolina MOD-1的产油性能,对影响MOD-1原生质体制备的酶液组分、菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类等因素进行优化。通过正交试验得到最佳酶液组合为:20mg/mL纤维素酶+20 mg/mL溶菌酶+5 mg/mL蜗牛酶。在此基础上应用响应面分析法获得影响MOD-1原生质体产量的显著因素有菌龄和渗透压稳定剂浓度,且均产生负效应。以此作为中心点进一步优化原生质体制备条件为:培养44.58 h的MOD-1菌丝,用0.66 mol/L KCl作渗透压稳定剂,30℃条件下酶解4 h。在此优化条件下,获得的MOD-1菌株原生质体产量可达7.06×106个/mL,优化条件具有实用价值。     

天然饲用着色剂β-胡萝卜素发酵培养基优化研究

以三孢布拉氏霉菌(+-、)为菌种,研究了β-胡萝卜素合成的发酵培养基,通过对不同碳、氮源的组合筛选,确定最佳的碳、氮源及发酵终止时间。结果表明:淀粉作为碳源,黄豆粉作为氮源,发酵144 h,β-胡萝卜素合成量最大,在此基础上,利用Plackett-Burman设计分析了发酵培养基中各成分对β-胡萝卜素产量的影响,发现β-紫罗酮、维生素B1、淀粉、植物油是影响β-胡萝卜素产量的主要因素。对上述因素以L(9 34)正交设计进一步优化,得到最佳的培养基组成淀粉41g/L、黄豆粉20g/L、植物油35mL/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁1 g/L、维生素B10.030 g/L、发酵40～44 h后,添加0.05%的异烟肼12 mL/L及10%的β-紫罗酮15 mL/L。β-胡萝卜素的发酵产量较比优化前发酵培养基提高了16.78%。     

固态混菌发酵生产饲用复合酶制剂营养条件和培养条件的研究

黑曲霉变种(A.niger v.Tiegh)CGMCC1182、黑曲霉MA-56(A.niger MA-56)CGMCC2722和黑曲霉XY-1(A.niger XY-1)CGMCC1182分别为α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶生产菌株。为获得高产α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的复合酶制剂,通过单因素实验,研究了黑曲霉三种菌株在固态发酵条件下产复合酶制剂的培养基组成和培养条件。结果表明,黑曲霉混菌发酵生产复合酶的最适培养基组成为:麸皮∶豆粕为7∶3(m/m),在此基础上(以麸皮和豆粕总量为10 g计算)添加玉米芯1.0 g,魔芋粉0.1 g,葡萄糖0.5 g,(NH4)2SO4 0.2 g,NaNO3 0.1 g,MgSO4 0.1 g,KH2PO4 0.2 g,H2O 11 mL。产酶最适培养条件为:培养温度30℃,固形物与加水比1∶1,α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶接种比例为5∶6∶6,接种混合孢子悬浮液2.5 mL(以一支菌种斜面加30 mL无菌水为标准),300 mL三角瓶中装量8 g培养基,发酵60 h时,复合酶产量达到最优,α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶制剂的活力分别可以达到221、894、10188 IU/g。     

甘蔗糖蜜废水生产饲料蛋白质的研究

本文选用白地霉GIM2.12和GIM2.14、热带假丝酵母GIM2.6、产朊假丝酵母GIM2.84个菌种,进行甘蔗糖蜜废水生产饲料蛋白质的菌种和发酵条件优选试验。试验结果表明,热带假丝酵母是能充分利用此种糖蜜废水生产饲料蛋白质的较好菌株,其最佳培养条件为:接种量10%,初始pH4.5,培养时间48h,摇瓶装液30mL/250mL,尿素和KH2PO4的添加量分别为1.6g/L和0.8g/L。在此条件下,饲料蛋白产量可达12.5g/L,化学耗氧量(CODCr)去除率为40%。     

灵芝漆酶在黑曲霉中的重组表达及发酵条件优化

【目的】 在黑曲霉（A.niger）中重组表达灵芝L菌漆酶基因，并对其发酵条件进行优化，旨在获得一株高产灵芝漆酶的黑曲霉基因工程菌。【方法】 从灵芝L菌克隆漆酶基因Lac-L，并根据黑曲霉密码子偏好性进行优化。选用黑曲霉糖化酶启动子（PglaA）、信号肽及终止子为表达原件，以米曲霉pyrG基因为筛选标记，构建漆酶表达盒，采用聚乙二醇-CaCl₂法将其转化至黑曲霉X1（ΔpyrG）原生质体中。对转化子进行PCR验证及固态发酵酶活测定，筛选高产漆酶重组菌株，并对阳性转化子固态发酵培养基碳源、无机与有机氮源比例、Cu²⁺浓度及发酵时间进行优化。【结果】 经尿嘧啶缺陷及含2，2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2，2'-azinobis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）培养基筛选获得25株重组漆酶转化子，酶活复筛获得灵芝漆酶异源表达6号重组菌株，发酵72 h酶活可达3 532.6 U/kg，宿主菌株的酶活仅为58.37 U/kg。重组6号菌优化后的最适固态发酵条件为：以麸皮为基础培养基，添加2%麦芽糖、2%（NH₄）₂SO₄、0.25 g/L CuSO₄，发酵60 h时重组菌株产漆酶活力最高，达到6 255.47 U/kg。【结论】 在黑曲霉中成功实现灵芝L菌漆酶基因Lac-L的异源表达。     

产β-甘露聚糖酶内生菌最适发酵条件的优化

植物内生菌是一类种类丰富、生物学功能多样的微生物。试验研究将黄豆中筛选出的1株酶活力较高的枯草芽孢杆菌内生菌HD-1,在摇瓶发酵培养水平,对发酵pH值、温度、转速、接种量、发酵时间及培养基成分进行优化。结果表明,发酵最适培养条件为:温度35℃、pH值7.0、转速200 r/min、发酵72 h、接种量5%;发酵最适产酶培养基组成:魔芋粉3%、(NH4)2SO40.375%;最优的离子浓度分别为FeSO40.001%、NaCl 0.5%、MgSO40.01%,此时HD-1的产酶水平达到98.3 U/ml,约是初始酶活力的1.8倍,发酵罐验证试验得到酶活高达193.12 U/ml。