水稻黑条矮缩病毒江苏玉米分离物全基因组序列及进化分析

 利用RT-PCR从江苏玉米上克隆水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的全基因组,其基因组10个片段核苷酸数目和蛋白编码情况与已报道的RBSDV分离物基本一致。 基因组的序列一致性分析和系统进化树表明,RBSDV基因组片段间存在频繁的RNA重排现象;江苏玉米分离物(JS)与湖北玉米分离物(HuB)和河北小麦分离物(HeB)的整体亲缘关系较近,而与安徽分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。综合本研究及前人对S8 和S10的研究,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同: S1、S2和S4中没有RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7 和S9存在较高频率重组,其中S7的高频率重组尤为显著。     

水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗体制备

为探讨水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）的种群变异,采用RT-PCR方法从感染RBSDV山东分离物RBSDV-JN1的水稻中克隆该病毒的S10片段,并进行序列分析,进而构建包含RBSDV-JN1的CP基因的原核表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达;并以表达的融合蛋白为抗原,制备病毒的多克隆抗体。结果显示：S10片段全长为1 801 bp,包含1个1 677 bp编码框,编码558个氨基酸的外壳蛋白（CP）;与GenBank已注册的19个RBSDV的CP基因序列相比较发现,病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为90.5%~99.8%,氨基酸的序列相似性为95.9%~100.0%;地理位置较近的分离物间序列相似性较高,RBSDV种群分布呈现区域性差异。原核表达载体pET-RBSDV-CP经IPTG诱导,获得了分子量约为63 kD带有His标签的目的蛋白。用该蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、Western blot和Dot-blot ELISA检测显示,效价为1：81 000,且具有良好的特异性。     

水稻瘤矮病毒P12蛋白抗血清制备及其应用

为了进一步研究水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)P12的功能,将RGDV-GX P12编码区亚克隆至原核表达载体,并导入大肠杆菌诱导表达;重组的P12融合蛋白经Ni-NTA His·Bind Resins纯化后用于免疫小鼠制备抗血清,并进行Western blotting分析。结果显示,约41 kD大小的RGDV P12融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达;利用该重组蛋白所制备的抗血清可特异地与融合表达和非融合的P12蛋白发生强烈的免疫学反应。利用该特异性抗血清在病毒粒子样品中检测不到P12蛋白,而在病株总蛋白样品中可检测到1条与预期大小一致的明显条带,表明RGDV P12是一种非结构蛋白。     

水稻齿叶矮缩病毒非结构蛋白Pns7在水稻原生质体内的表达动态

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)。该病毒编码的非结构蛋白Pns7在昆虫细胞中可形成伸出细胞膜的纤维丝状结构。本研究利用水稻原生质体培养体系,对Pns7蛋白在水稻原生质体内的复制与表达情况进行了分析。本研究首先构建了Pns7蛋白的原核表达载体,通过IPTG诱导获得大量Pns7蛋白,免疫兔子获得抗血清。Western blot证明抗血清具有特异性,间接ELISA测得其效价为1∶2 500。利用实时荧光定量PCR技术,对病毒侵染水稻原生质体后的Pns7 RNA含量进行检测,结果表明:Pns7 RNA在8 h时开始积累,24h左右达到最大值,32 h后表达量维持在一个平台期;同时,以制备的抗血清为探针,通过Western blot检测到Pns7蛋白在病毒侵染原生质体后16 h开始表达,32 h左右达到最大值,60 h后开始下降,但仍保持在较高水平。     

水稻瘤矮病毒S11基因沉默抑制子的原核表达及抗血清制备

以采自广东省水稻瘤矮病的典型病株为材料,通过RT-PCR法扩增和克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)S11组分核苷酸序列全长。序列分析结果表明,RGDV广东分离物S11(登录号EF532326)核苷酸序列全长1168bp,含有一个1068bp的开放阅读框,编码一条355个氨基酸的多肽,推测分子量约40kD,与泰国分离物基因结构基本一致,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为94.3%和98.8%。将广东分离物S11基因克隆至pBV221温敏表达载体上,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。以诱导蛋白为抗原免疫家兔获得了抗血清。利用ELISA法测定抗血清的效价为1∶4096,Western blot分析结果表明,抗血清能与S11蛋白发生特异血清学反应。这可为进一步研究S11蛋白的结构和功能,揭示其抑制基因沉默的作用机制提供参考。     

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S7片段的克隆及其S7-1基因编码蛋白的原核表达

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克隆到原核表达载体p ET-GST上,重组质粒p ET-S7-1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导及Ni~(2+)-NTA亲和柱纯化融合蛋白,再进行Western blot检测。结果显示,SRBSDV安徽分离物S7片段与其它SRBSDV各个分离物S7片段的序列相似性极高,达99.3%~99.9%,而与斐济病毒属Fijivirus其它种之间的序列相似性较低,为35.5%~73.3%。SRBSDV安徽分离物与其它SRBSDV各个分离物聚成1个单独的分支,彼此间亲缘关系较近。试验获得了分子质量约为68 k D的S7-1融合蛋白,且GST单抗能够与S7-1融合蛋白发生特异性反应,表明本研究得到的融合蛋白确为靶标蛋白。     

玉米黄花叶病毒运动蛋白的原核表达纯化与抗血清制备

为实现对玉米黄花叶病毒（maize yellow mosaic virus,MaYMV）的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白（movement protein,MP）的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128 000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性...     

水稻锯齿叶矮缩病毒抗血清的制备及其应用

 采用人工接种发病的水稻锯齿叶矮缩病株茎叶的榨出液,以低速离心(4000rpm)结合聚乙二醇(PEG)的方法所得部分提纯的病毒,进行家兔免疫注射制备抗血清,结果以注射后3~4周的效价最高,可达1:4096,α-最适比值为1:13。应用这种方法制备成的水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)的抗血清,进行了水稻矮缩病毒(RDV)病株与RRSV病株的鉴别诊断和RRSV毒源寄主的检测。结果证明,具卷叶、缺刻的RDV病株确非RRSV复合感染所致。毒源寄主测定表明,在供试的7种田间常见杂草中,有5种表现为阳性反应;经生物学回接证实,5种中有蟋蟀草、水蜈蚣和游草3种能成功地将RRSV传给水稻而引起发病。     

甘蔗黄叶病毒运动蛋白的原核表达和抗血清制备

 甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP)的基因连接到pDB-His-MBP原核表达载体上,转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,经IPTG诱导,表达分子量大小约为70 kDa的融合蛋白,将纯化后的融合蛋白制备多克隆抗血清。利用western blot检测抗血清的效价为1:128 000,灵敏度为1:256,抗血清不与马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的其它病毒以及黄症病毒属(Luteovirus)病毒发生交叉反应,具有很好的特异性。本文制备的ScYLV MP抗血清可以用于ScYLV的检测,并为深入研究ScYLV与寄主的相互作用等问题提供材料基础。     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程

 水稻黑条矮缩病毒 (Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) 由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以持久增殖型方式传播, 其编码的P9 1蛋白是形成病毒复制和子代病毒粒体装配的场所—病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确RBSDV在介体昆虫体内的侵染循回过程, 本研究通过原核表达的P9 1蛋白免疫注射兔子制备P9 1抗体, 应用免疫荧光标记技术研究P9 1在饲毒后不同时期的介体灰飞虱体内的定位。共聚焦显微镜观察到饲毒后3 d, P9 1出现在介体中肠的少数上皮细胞内;饲毒后6 d, 在中肠外表的肌肉细胞分布有P9 1;饲毒后10 d, P9 1分布于中肠和后肠表面的肌肉, 同时在唾液腺也能观察到P9 1的存在。结果表明RBSDV在介体灰飞虱体内首先侵染中肠上皮细胞并复制, 随后扩散到中肠表面的肌肉细胞, 并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后肠, 最后扩散到唾液腺。本研究首次直观地阐述了RBSDV在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程, 为有效阻断灰飞虱携带并传播病毒奠定基础。     

番茄斑萎病毒运动蛋白NSm的原核表达及抗体制备

 将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)运动蛋白NSm基因克隆到原核表达载体pET-32a (+) 中,利用大肠杆菌系统表达NSm蛋白,以Ni^2＋-NTA agarose亲和柱纯化该蛋白与His组氨酸的融合蛋白,免疫家兔制备融合蛋白多克隆抗体。Western blot检测显示,该抗体与NSm重组蛋白以及普通烟病叶中的NSm蛋白具有特异性反应。采用该抗体对TSWV感染的普通烟叶片低温超薄切片进行免疫胶体金标记,透射电镜观察发现特异性金颗粒主要定位在病叶细胞的胞间连丝中,而健康烟草叶片组织中没有金颗粒特异性标记。结果表明,该抗体可用于研究NSm在细胞中的定位。     

引起玉米粗缩病的水稻黑条矮缩病毒河南分离物的分子特征

<正>目前已报道的造成玉米粗缩病的病原有3种,分别是玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus,M RDV),水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)[1]。我国于1954年在新疆和甘肃发现该病,上世纪60年代曾在中东部夏玉米区流行,至70年代以来各玉米产区已陆续发生[2],近年来在黄淮海夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米田发生危害严重。     

水稻黑条矮缩病毒S6片段的序列多样性与进化分析

<正>0 引言植物RNA病毒在进化中具有快速变异的能力，有利于病毒扩大寄主范围甚至进化为新病毒[1]。突变和重组是植物RNA病毒变异和遗传多样性的共同进化因素，是群体基因变异的最初来源[2]。由灰飞虱传播的水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) 属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus),能引发玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病。     

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

 根据已报道的大麦黄矮病毒GPV株系(BYDV-GPV)相关基因序列设计合成引物,利用RT-PCR方法获得ORF4基因,并将其克隆到原核表达载体pET-5a中。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析,结果表明:ORF4基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中获得了高效表达,分子量为17 kDa。以回收的表达产物为抗原免疫家兔,制备了BYDV-GPV 17kDa蛋白的特异性抗血清。Western blot检测结果,制备的抗血清可用于检测BYDV-GPV侵染后在燕麦体内表达的17 kDa蛋白。     

辣椒轻斑驳病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。     

An Antibody Against the SecA Membrane Protein of One Phytoplasma Reacts with Those of Phylogenetically Different Phytoplasmas

ABSTRACT Antisera raised against phloem-limited phytoplasmas generally react only with the phytoplasma strain used to produce the antigen. There is a need for an antiserum that reacts with a variety of phytoplasmas. Here, we show that an antiserum raised against the SecA membrane protein of onion yellows phytoplasma, which belongs to the aster yellows 16S-group, detected eight phytoplasma strains from four distinct 16S-groups (aster yellows, western X, rice yellow dwarf, and elm yellows). In immunoblots, approximately 96-kDa SecA protein was detected in plants infected with each of the eight phytoplasmas. Immunohistochemical staining of thin sections prepared from infected plants was localized in phloem tissues. This antiserum should be useful in the detection and histopathological analysis of a wide range of phytoplasmas.     

Molecular characterization,phylogenetic comparison and serological relationship of the Imp protein of several ‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia’ strains

The immunodominant membrane protein Imp of several phytoplasmas within the ‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia’ (16Sr‐II) group was investigated. Eighteen isolates from Iran (11), East Asia (5), Africa (1) and Australia (1) clustered into three phylogenetic subgroups (A, B and C) based on the 16S rDNA and imp genes, regardless of geographic origin. The imp gene sequences were variable, with more non‐synonymous than synonymous mutations (68 vs 20, respectively), even though many of the non‐synonymous ones (75%) produced conservative amino acid replacements. Eight codon sites on the extracellular region of the protein were under positive selection, with most of them (75%) coding for non‐conservative amino acid substitutions. Full‐length (21 kDa) and truncated (16 kDa) Imp proteins of two economically important Iranian phytoplasmas [lime witches’ broom (LWB) and alfalfa witches’ broom (AlWB‐F)] were expressed as His‐tagged recombinant proteins in Escherichia coli. An antiserum raised against full‐length recombinant LWB Imp reacted in western blots with membrane proteins extracted from LWB‐infected periwinkle and lime, indicating that Imp (19 kDa) is expressed in infected plants and is a membrane‐associated protein. The same polyclonal antibody also detected native Imp in proteins from periwinkles infected by phytoplasmas closely related to LWB (subgroup C) only, confirming phylogenetic clustering based on 16S rDNA and imp genes. Imp proteins of LWB and AlWB‐F isolates were also recognized by an antiserum raised against an enriched preparation of AlWB‐F phytoplasma cells, demonstrating the antigenic properties of this protein.