烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)介导的体外复制体系

通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)中国分离物RdRp的编码序列,构建以pMALC2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。温度梯度实验显示,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBPRdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3'末端序列,催化体外复制;对正负链的3'末端的体外复制效率存在差别,识别负链3'末端的体外复制效率明显高于正链3'末端。本研究创建的TBTV RdRp介导的体外复制体系为进一步研究TBTV基因组复制调控奠定了基础。     

融合海肾荧光素酶的重组病毒在移码和通读研究中的应用初探

<正>海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,Rluc)可催化腔肠素(coelenterazine)氧化产生高能量中间产物,氧化过程同时发出蓝色生物荧光,最强荧光波长465 nm。鉴于荧光素酶生物发光的高灵敏度检测特性,由海肾荧光素酶和另一种萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,Fluc)组成的单报告和双报告基因检测系统广泛应用于生命科学研究领域,如遗传毒性检测、信号通路研究和某些顺式作用元件的     

烟草丛顶病毒ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用

PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗血清,间接ELISA检测效价为1:24 3000。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中ORF1蛋白,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。另外发现ORF2蛋白以ORF1延长蛋白的形式存在,根据ORF1和ORF2的重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构,推测此ORF1延长蛋白是移码翻译产物。     

水稻黑条矮缩病毒江苏玉米分离物全基因组序列及进化分析

 利用RT-PCR从江苏玉米上克隆水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的全基因组,其基因组10个片段核苷酸数目和蛋白编码情况与已报道的RBSDV分离物基本一致。 基因组的序列一致性分析和系统进化树表明,RBSDV基因组片段间存在频繁的RNA重排现象;江苏玉米分离物(JS)与湖北玉米分离物(HuB)和河北小麦分离物(HeB)的整体亲缘关系较近,而与安徽分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。综合本研究及前人对S8 和S10的研究,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同: S1、S2和S4中没有RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7 和S9存在较高频率重组,其中S7的高频率重组尤为显著。