禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。     

H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

禽流感病毒 H9和 N2基因双重 RT-PCR 方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒（AIV ）的方法,根据AIV H9和N2基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了 H9亚型和N2亚型AIV双重RT‐PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT‐PCR扩增,可得到545 bp H9基因条带和341 bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341 bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性;结果表明该双重RT‐PCR最低能检出100 fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

禽流感病毒H9和N2亚型双重RT-PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测H9及N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据AIV H9亚型和N2亚型基因序列,分别设计了2对针对H9亚型AIV的HA基因和N2亚型AIV的NA基因的引物,建立了H9亚型和N2亚型AIV双重RT-PCR检测方法。对H9N2亚型AIV的RNA模板进行RT-PCR扩增,可得到545bp H9基因特异性条带和341bp N2基因的特异性条带;对非H9亚型的N2亚型AIV进行扩增,则仅出现1个特异性扩增条带,即341bp N2基因条带;对非H9或N2亚型AIV和其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。结果表明该双重RT-PCR最低能检出100fg H9N2亚型AIV的cDNA模板。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。     

H1和H3亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立

为建立简便、快速同时检测H1和H3亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的方法,根据GenBank中H1亚型AIV-HA基因和H3亚型AIV-HA基因的序列,分别设计了2对针对H1AIV和H3 AIV的保守基因序列的引物.应用这2对引物对混有H1 AIV和H3 AIV的模板进行二重PCR扩增,得到了2个特异性扩增条带,大小与试验设计相符的302 bp(H1 AIV)和626 bp(H3 AIV),而对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体的PCR扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出50Pg的H1 AIV模板和26 pg的H3 AIV模板.     

鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型及N1-N9亚型RT-PCR方法的建立

快速检测和鉴定禽流感病毒(AIV)亚型对该病的防控具有重要意义。参考文献报道设计合成引物,采用二步RT-PCR方法,从H5/H7亚型AIV血凝抑制抗原和H9鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,建立禽流感病毒通用、H5/H7/H9亚型和N1-N9亚型鉴定方法。结果表明:针对AIV基质蛋白基因(M)和核蛋白基因(NP)的通用检测方法能有效扩增出目的条带;鉴别H5/H7/H9亚型的复合PCR扩增结果与预期目标一致;鉴别N1-N9亚型PCR方法扩增出N1/N2/N6/N9亚型目的条带;与其他4种常见病原无交叉反应。初步应用该方法检测样品,证明该方法对禽流感快速诊断和亚型鉴定具有潜在的应用价值。     

H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术的建立与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,参考Gen Bank登录的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA、M基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计3对可扩增HA、NA、M基因的特异性引物以及反转录引物。3对引物扩增的c DNA片段大小分别为1 742、1 410、1 027 bp。结果:通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,与目的片段大小相符的片段,经测序均正确,且与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对HA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对NA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对M基因的最低检出量为10-3μg/μL c DNA。通过对30份H9N2阳性病毒液进行三重PCR,均可同时扩出HA、NA、M基因。结果表明,本试验建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,为提高H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M基因序列分析的效率奠定基础。     

OE-PCR法扩增获得犬瘟热病毒缺失疏水区的融合蛋白基因片段

根据犬瘟热病毒（CDV）Onderstepoort株的核苷酸序列，设计合成引物，通过RT-PCR．从CDV Onderstepoort株RNA中扩增出2197bp的CDV全长融合蛋白（F）基因。将其与pGEM-T easy载体连接．通过软件分析其序列中的疏水区后，以pGEM-T／F为模板．PCR扩增出约254bp和1017bp的F蛋白疏水区外编码序列。以2个扩增产物为模板，以OE-PCR（overlap extension-PCR）扩增出约1271bp的缺失疏水区的F基因（dF）．测序结果表明．dF的序列除在疏水区以4个甘氨酸序列替代外，其余部分与F基因的同源性为99.2％。这表明，OE-PCR扩增法已成功地使CDVF基因疏水区缺失。     

禽流感病毒A/goose/China/24/96(H7N3)分离株NP基因片段的克隆及其序列同源性分析

本文首次以广东禽流感无致病力分离株A/goose/China/24/96（H7N3）核蛋白（NP）基因核酸为模板，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR）技术，扩增出了预计的830bp左右的片段。将此扩增产物在克隆进pEGM-4Z载体，采用限制性内切酶、地高辛标记探针和序列测定对该重组质粒进行了鉴定。测出的NP序列经 Blast2.0比较，与GenBank中收录的AIV其它病毒株NP基因相应片段的同源性在91%以上。     

禽流感病毒M2蛋白的原核表达及免疫原性研究

基质蛋白M2是流感病毒的3种表面抗原之一,也是流感病毒中最为保守的蛋白之一,被认为是具有交叉保护能力的流感疫苗的理想候选抗原。论文从H9N2亚型禽流感病毒感染的狗肾传代(madindarby canine kidney,MDCK)细胞中克隆全长M2基因,并采用OE-PCR(overlap extension,PCR)得到缺失跨膜区的M2基因(sM2)。将sM2基因克隆到pGEX-KG原核表达载体,在大肠埃希菌中获得表达量较高的融合蛋白GST-sM2,而且以可溶形式存在。利用亲和层析的方法纯化蛋白,经Western blot证明,GST-sM2蛋白具有良好的免疫原性。ELISA检测发现GST-sM2能与H9、H5和H7亚型禽流感病毒抗体均发生反应。进一步将纯化蛋白与佐剂混合后免疫Balb/c鼠,结果在免疫小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,为开发具有交叉保护力的禽流感疫苗奠定了基础。     

野鸭源H6N2亚型禽流感NS基因的克隆及序列分析

根据GenBank上已发表的H6N2亚型的非结构蛋白基因（NS）序列,设计一对特异性引物,成功从本实验室分离、保存的H6N2禽流感病毒分离株A／Mallard／SanJiang/151／06（H6N2）中克隆到NS基因序列。该克隆基因全长860bp,编码NS1和NS2两种非结构蛋白,与其他H6N2亚型的NS基因进行同源性比较,同源性为71．1％～97．2％,推导的氨基酸序列同源性为62．0％～94．6％。     

鸭肠炎病毒基因组末端的克隆及序列分析

根据已知的鸭肠炎病毒基因组序列设计2对引物RTLT1、RTLT2,取基因组自连产物进行PCR反应,分别得到全长16071、978 bp的序列。将PCR产物克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行PCR和酶切鉴定,将阳性质粒测序,结果显示2对引物扩增的重叠序列部分完全一致。该段序列G+C含量高达75%,含有大量直接和反向重复序列,并发现4个末端特征序列,分别为具有回文结构的α序列、包含两测末端接合位点的β序列、高度保守序列的γ序列和AnTn序列。将该序列与马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、猪伪狂犬病毒(PRV)末端序列进行比较,证实所得到的序列为鸭肠炎病毒基因组末端序列,这些特征序列的发现对进一步了解DEV复制机制有很大帮助。     

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒（ARV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp（ARV）、264bp（AIV）、362bp（NDV）和459bp（IBV）,且特异性、敏感性良好,能够检出1pgAIV和10PgARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

禽流感病毒分离株 A/Chicken/Wangcheng/4/2001(H9N2)核蛋白基因(NP)的克隆和序列分析

用无特定病原体 (ＳＰＦ)鸡胚增殖禽流感鸡体分离株Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｗａｎｇｃｈｅｎｇ／４／２００１(Ｈ９Ｎ２)(ＷＣ２００１),提取病毒总ＲＮＡ。根据已发表的Ａ型流感病毒株ＮＰ基因序列 ,设计一对引物 ,运用反转录 -聚合酶链反应(ＲＴ -ＰＣＲ)扩增该病毒分离株的ＮＰ基因 ,克隆后进行序列测定。序列分析表明 ,扩增的ＮＰ基因为相应的开放阅读框架。ＷＣ２００１株ＮＰ基因序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较 ,相互间同源性在８０%左右 ,其中与Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｙ２８０／９７(Ｈ９Ｎ２)有很高的同源性 ,而与人流感病毒株和猪流感病毒株差异较大 ,显示禽流感病毒特征。