化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

 探索了离子霉素结合细胞松驰素B（cytochalasin B, CB）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）以及6-二甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine, 6-DMAP）等化学物质，对猪卵母细胞激活后发育的影响。试验1，体外成熟卵母细胞分别用15、20、25、30 mol·L-1的离子霉素处理40 min或电激活（1.3 kV·cm-1，80 s,1次脉冲），结果表明，20 mol·L-1组的激活率（69.93±5.80）%显著高于15 mol·L-1组（P <0.05），但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验2，卵母细胞采用20 mol·L-1离子霉素分别激活10、20、30、40、50 min，再用2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，其中，40 min组的卵裂率、囊胚率[（72.40±13.02）%、（25.37±11.43）%]较高，但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验3，卵母细胞经离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，分别用7.5 g·ml-1 CB、10 g·ml-1 CHX、2 mmol·L-1 6-DMAP、7.5 g·ml-1 CB +10 g·ml-1 CHX和7.5 g·ml-1 CB +2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，2 mmol·L-16-DMAP组的激活率、卵裂率和囊胚率[（86.05±4.29）%、（61.77±8.10）%和（21.62±3.31）%] 显著高于7.5 g·ml-1 CB组（P <0.05）与另外几组差异不显著（P >0.05）。试验4，卵母细胞由离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，用2 mmol·L-1 6-DMAP分别处理3.5、5.5、7.5 h，5.5 h组的卵裂率和囊胚率[(66.59±14.36)%和(25.40±10.16)%]高于另外两组，但差异不显著（P >0.05）。结果表明，离子霉素（20 mol·L-1、40 min）+6-DMAP（2 mmol·L-1 、5.5 h）为最佳激活方案。离子霉素激活卵母细胞后，CB与CHX、6-DMAP的互作对卵子的发育有抑制作用。     

昆明白小鼠卵母细胞去核研究

为了提高昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞的去核效率及质量,该研究在不同条件下,比较了小鼠卵母细胞的去核效果:将小鼠MⅡ期卵母细胞放入含蔗糖浓度分别为0.01、0.02、0.03 g/mL的M2-液微滴中,在体式显微镜下观察显核效果以确定最佳浓度;将有清晰可见细胞核的卵母细胞放入含细胞松弛素B(Cytocha-lasin-B,CB)浓度分别为5、7.5、10μg/mL操作液中去核,显微镜下确定去核率。结果表明:操作液中加入蔗糖浓度为0.02g/mL时显核效果最好;去核时操作液中细胞松弛素B浓度为10μg/mL时去核死亡率最低。     

应用负压气相培养系统生产体细胞克隆牛的研究

 以 - 35℃低温冷冻保存 3个月的Vari Fe 8mos和Fahru Fe 9mos死亡牛胎儿皮肤上皮细胞 ,为核供体细胞 ,应用点击去核方法 ,和 - 30 0mmHg、2 %CO2 、8%～ 10 %O2 、38.5℃和 10 0 %湿度负压气相培养系统 (负压组 ) ,进行了克隆牛试验研究 ,并与吸引和挤压及常压培养法进行了比较。结果表明 ,采用点击去核法对体外成熟培养18h、2 2h、2 4h的卵母细胞进行去核 ,去核成功率分别为 90 .0 %、75 .8%和 5 5 .6 %,18h组显著高于 2 2h组 (P <0 .0 5 ) ,极显著高于 2 4h组 (P <0 .0 1) ;而且 ,点击去核法去核率为 90 .0 %,极显著地高于吸引法的 6 8.3%(P <0 .0 1) ,与挤压法去核率 88.3%差异不显著 ;采用点击去核法囊胚发育率达 34 .1%,显著高于吸引法的 18.0 %(P <0 .0 5 ) ,与挤压法的 2 0 .9%差异不显著。负压组重构胚的卵裂率达 70 .0 %,显著高于常压组的 6 3.8%(P <0 .0 5 ) ,负压组囊胚发育率达 35 .8%,极显著高于常压组的 2 3.2 %(P <0 .0 1) ,负压组克隆囊胚细胞数为 10 8± 3.3个 ,极显著多于常压组的 98± 3.3(P <0 .0 1)。将第 6天的克隆桑椹胚和囊胚每 2～ 3枚装入 1支 0 .2 5ml塑料细管中 ,移植给同期发情处理的 5头受体奶牛的黄体侧子宫角中 ,最终获得 2头牛妊娠 ,并于 2 0 0 1年 11月 3日和 11月 6     

CCB、蔗糖及成熟时间对山羊卵母细胞去核效果的影响

分离培养山羊卵母细胞,采用盲吸法去核,研究不同成熟培养时间(18,22和26 h)不同细胞松弛素B(CCB)浓度(5,7.5,10,15 mg/L)和不同蔗糖浓度(20,25,30 g/L)对卵母细胞去核效果的影响。结果表明,山羊卵母细胞最佳去核条件为:卵母细胞体外成熟时间为22 h,去核时操作液中CCB质量浓度为7.5 mg/L,蔗糖质量浓度为20 g/L。     

小鼠不同卵龄卵母胞细纺锤体位置及对去核效率的影响

探讨小鼠不同卵龄卵母细胞纺锤体位置与去核效率之间的关系。用Spindle-View观察小鼠不同卵龄卵母细胞纺锤体位置,然后对其进行去核操作。观察发现卵龄10,12h的纺锤体处于I,II,III区的比率分别为95%,3%,2%;33%,33%,23%。两组进行盲吸去核,去核率分别为90%和22%。在Spindle-View下去核卵龄10h的卵母细胞去核率为95%,其中有56%(n=59)的卵母细胞去不到1/6的卵胞质就可去核,而卵龄12h的卵母细胞去核率为87%,其中有76%(n=85)的卵母细胞吸去1/3的卵胞质才可去核。小鼠卵母细胞不同卵龄对纺锤体位置和核移植程序中去核效率有显著影响。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

小鼠卵母细胞去核方法的研究

用 McGrath 和 Solter 的去核方法和改进的胚胎染色体制备技术,研究小鼠卵母细胞去核的基本方法及吸出的胞质量和极体的有无对去核率的影响。实验表明:(1)小鼠卵母细胞透明带弹性很差,去核操作成功率仅53.8%;(2)制备卵母细胞染色体,无需用秋水仙素等处理,直接经2～3min 低渗处理便可使第2次减数发裂中期染色体充分展开;(3)小鼠卵母细胞去核时抽1/4胞质的染色体全部去除率(49%)和抽1/3胞质的(54%)差异未达到显著水平(P>0.05);(4)注射 HCG 后15～16h 获取的小鼠卵母细胞,只有1/3左右具有明显的第1极体;抽取无极体卵母细胞之卵周隙较大一侧的细胞质,去核率与见极体卵母细胞的无明显差异。     

IGF-I、TGF-α、bFGF对猪卵母细胞体外成熟和卵裂的影响

 研究了IGF-I、bFGF、TGF-α 3种细胞因子单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后卵裂的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明，3种细胞因子对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应（1）20 ng·ml-1的IGF-I的成熟率和卵裂率显著的高于对照组和10、30、40、50、100 ng·ml-1组[（85.3 ±2.11) %，（85.4±2.81）%；（71.1 ±1.91）%，（62.5 ±0.98）%；（77.5 ±2.5）%，（59.1 ±3.93）%；（61.9 ±1.72）%，（54.3 ±3.48）%；（58.6 ±4.26）%，（53.1 ±1.23）%；（44.4 ±5.10）%，（49.8 ±3.55）%；（33.9 ±3.48）%，（46.1 ±3.59）%，P <0.05)，当IGF-I的浓度达到100 ng·ml-1时,成熟率（33.9±3.48）%和卵裂率（46.1±3.59）% 降低，与其它各组相比差异显著（P < 0. 05）。（2）20 ng·ml-1的bFGF的成熟率（85.0 ±1.70）%和卵裂率（85.0±2.82）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（3）15 ng·ml-1的TGF-α的成熟率（86.9±0.46）%和卵裂率（86.3±2.01）%最高,和其它各组相比,差异显著（P < 0.05）。（4）15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1bFGF联用组，卵母细胞成熟率和分裂率显著高于20 ng·ml-1 bFGF和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；15 ng·ml-1TGF-α和20 ng·ml-1 IGF-I联合组；与20 ng·ml-1 bFGF、20 ng·ml-1 IGF-I和15 ng·ml-1 TGF-α三者联用组。[（89.2±1.44）%和（88.8±0.17）%.（75.6±0.98）%和（78.3±1.65）%；（77.2±2.54）%和（80.2±2.26）%；（76.4±1.28）%和（77.4±3.73）%，P <0.05]。     

山羊不同来源卵母细胞体外受精的研究

从屠宰场搜集的小母羊(3-6月)卵巢卵母细胞(A组)、成年母羊卵巢卵母细胞(B组)及成年母羊超排后活体所取母细胞(C组)进行了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)及受精后早期胚胎体外培养(IVC)的比较研究。研究发现: (1)A组平均每个卵巢获取的卵母细胞数极显著高于B组(10. 6±2. 6vs2. 5±1. 5,P< 0. 01),与C组相比差异不显著(10. 6±2. 6vs11. 0±2. 0, P> 0. 05),但获取的优良可用卵丘卵母细胞复合体(COCS)数A组极显著高于B组(4. 5±2. 5vs1. 6±1. 5,P< 0. 01),却显著低于C组(4. 5±2. 5vs8. 5±2. 5,P< 0. 05); (2)A,B,C组获取的可用卵母细胞在M199±10%EGS±20ng/mLEGF培养液中培养后的体外培养成熟率分别为63. 8%, 65%和68. 3%,差异均不显著(P> 0. 05); (3)3种来源途径的可用卵母细胞体外成熟后用mDM液获能受精处理并培养于TCM 199-卵丘颗粒细胞饲养层(cc)共培养体系中的卵裂率(37. 5%, 35. 0%和40% )无显著差异; 12枚活体来源卵母细胞生产的2-8细胞胚移植给4只同期化受体,其中1只母羊怀孕并产下2只“试管”羔羊(16. 7% )。研究表明:初情期前小母羊比成年母羊可提供更多可用于体外受精的卵母细胞,进而提高雌性动物的早期繁殖潜能;对遗传性能较好的品种或个体可通过超数排卵处理后利用合适     

不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨体外受精时不同精子浓度对精子穿入成熟卵母细胞及后续发育的影响。[方法]以冷冻-解冻精子为材料,以1×106、1×107个/ml 2种精子浓度进行体外受精,研究不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响。[结果]当精子浓度为1×106、1×107个/ml时,精子穿入率分别为83.18%、88.23%,单精入卵率分别为40.55%、9.02%,多精入卵率分别为59.45%、90.98%,平均每个卵母细胞中的精子数分别为2.03、3.26个,雄原核形成率分别为84.10%、86.40%,单精入卵率、多精入卵率有显著差异(P<0.05),其他指标无显著差异(P>0.05)。[结论]该研究为应用冷冻-解冻精子建立猪卵母细胞的体外生产系统提供了依据。