反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的分离鉴定及分型研究

为了弄清反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的生物学特性和分子特征,本研究从新疆不同地区规模化养殖场和屠宰场采集158份牛羊临床病料,进行产气荚膜梭菌的分离培养;通过形态学、生化特性、16S rRNA序列分析对产气荚膜梭菌分离株进行鉴定;利用多重PCR技术扩增产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、β2基因,将测序结果与NCBI数据库比对进行新疆流行株的基因分型。结果从158份临床病料中共分离出产气荚膜梭菌67株,形态学、生化和16S rRNA序列分析鉴定结果均为产气荚膜梭菌。毒素基因检测表明,其中α基因检出率为100.00%(67/67),ε基因检出率为17.91%(12/67),β2基因检出率为37.31%(25/67),β、ι基因未检出。毒素基因分型可将产气荚膜梭菌新疆流行株分为A、D型,其中A型占82.09%(55/67),D型占17.91%(12/67),提示产气荚膜梭菌新疆流行株优势型别为A型。本研究为产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供科学依据。     

牛出血性肠炎A型产气荚膜梭菌的分离鉴定

从新疆维吾尔自治区某牛场采集的3份疑似出血性肠炎病料中分离到8株产气荚膜梭菌,用PCR扩增保守基因16SrRNA,并进行序列测定和同源性分析,再通过多重PCR方法扩增型特异性基因进行分离菌株的分型鉴定。结果显示,所分离的8株产气荚膜梭菌之间16S rRNA基因同源型为100%,与GenBank参比序列同源性在99.8%以上,确定为产气荚膜梭菌。遗传进化分析表明,本次分离的8株产气荚膜梭菌之间拥有共同起源,但与所用的参考菌株分属不同来源。多重PCR扩增结果显示,8株菌株均为产气荚膜梭菌A型。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。     

羊源性D型产气荚膜梭菌的分离及PCR鉴定

对青海省互助县送检的2份病死羊组织,经细菌学厌氧分离培养,参考已发表的产气荚膜梭菌16S rRNA基因和毒素基因(α、β、ε、ι)合成引物,采用PCR和多重PCR扩增目的基因条带,并对分离株细菌的16S rRNA基因序列进行了同源性及系统发育分析。结果显示:从其中1份病死羊组织中分离获得1株β溶血型革兰阳性杆菌,经PCR和多重PCR扩增可得16S rRNA基因和α、ε毒素基因的目的条带;分离株细菌的16S rRNA基因序列与GenBank上已登录(登录号:NR113204.1、NR121697.2)的产气荚膜梭菌的相应序列具有高度同源性(≥99.0%),同KU714939.1的遗传关系最为亲密,因此经分子生物学方法鉴定分离株细菌为D型产气荚膜梭菌。     

产气荚膜梭菌cpe~+菌株的筛选与鉴定

参考相关资料,针对产气荚膜梭菌肠毒素基因(cpe)设计合成1对特异性引物,对34株贵州分离株进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序和分析。结果在34株产气荚膜梭菌贵州分离株中有1株C型菌株扩增出与预期大小相一致的目的片段,经克隆测序后,该片段大小为233 bp,其与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99.6%~100%,推导氨基酸同源性为98.7%~100%,表明所扩增产物为产气荚膜梭菌的肠毒素基因片段。本试验筛选鉴定出1株产气荚膜梭菌cpe+菌株,为今后进一步探讨产气荚膜梭菌性食物中毒机制奠定了基础。     

甘肃省牛和羊源产气荚膜梭菌耐药性分析

旨在探究甘肃省牛和羊产气荚膜梭菌的流行情况及对常用抗菌药物的耐药性.对采集自甘肃省不同地区的229份牛、羊源肛拭子进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定,并对分离到的产气荚膜梭菌菌株进行毒素基因检测、最小抑菌浓度(MIC)测定及四环素耐药菌株的同源性分析.结果表明,在229份样品中分离到53株A型产气荚膜梭菌,分离率达23.1％...     

牦牛源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】2023年4月至2023年5月，西藏拉萨市多地出现牦牛严重腹泻、便血甚至死亡的现象。试验旨在确定牦牛腹泻的病原菌并研究其生物学特性，以期为该地区牦牛腹泻病的防治提供参考。【方法】采集新鲜牦牛腹泻粪便样品进行厌氧培养，通过培养特性及染色镜检进行初步鉴定；对可疑阳性菌株进行生化特性、多重PCR毒素基因分型及cpe、netB、cpb2毒素鉴定，并进行cpa、cpb2、16S rRNA基因的遗传进化分析、部分分离株生长曲线测定及动物致病性试验；采用K-B法测定分离株的体外药物敏感性，统计不同分离株的多重耐药结果。【结果】从样品中分离纯化得到8株分离菌，在厌氧培养基中生长旺盛，在TSC培养基、5%脱纤维绵羊血平板、卵黄琼脂培养基上均呈现与产气荚膜梭菌相似的典型菌落，革兰染色为紫色大杆菌，初步判定为产气荚膜梭菌，命名为XZ-1～XZ-8。分离株生化检测结果与产气荚膜梭菌相符；分离株均携带cpa和cpb2基因，为A型产气荚膜梭菌；16S rRNA基因分析结果显示，8株分离株与产气荚膜梭菌参考株的相似性为97.3%～100%,在系统进化树中处于同一分支，而与屎肠球菌、大肠杆菌参考株处于不同分支...     

产气荚膜梭菌多重PCR定型方法的建立及其应用

建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,只有产气荚膜梭菌呈现阳性,被检验的其他梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性;将肉汤菌液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×104CFU/mL。收集40份牛粪便样品,进行PCR检测,32份样品中成功扩增出589 bp的α毒素基因片段,阳性率为80%。结果显示,建立的多重PCR检测方法可取代血清中和试验,用于产气荚膜梭菌分型,同时表明A型产气荚膜梭菌在当地奶牛场中较为普遍。     

迁徙候鸟产气荚膜梭菌的分离鉴定与特性分析

产气荚膜梭菌是一种人兽共患病原菌,可通过多种途径感染人类。本研究从迁徙候鸟样品中对产气荚膜梭菌进行分离鉴定,并进行毒力基因检测、分型、生物被膜形成能力鉴定及耐药性测定。结果从549份健康候鸟粪便样品中分离细菌42株,35只死亡候鸟病料样品中分离细菌11株,通过PCR方法共鉴定A型菌48株,E型菌5株,所有菌株均未检出β2毒素、肠毒素和NetB毒素基因,30株经测定能够形成生物膜;分离菌株对黏菌素、杆菌肽、克林霉素和红霉素的耐药率在40%以上,所有菌株均对复方新诺明敏感。结论得出迁徙候鸟携带产气荚膜梭菌的比例较低,但是对部分抗生素的高耐药性值得关注。     

牛奶中产气荚膜梭菌的分离鉴定和带菌量测定

调查陕西关中地区牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况及其优势血清型和携带的毒素基因。通过对3个奶牛场采集的86份牛奶样品进行细菌分离纯化,应用多重PCR鉴定分离菌株的血清型,进行cpb2、cpe毒素基因检测,并对场3的乳样按照GB 4789.13-2012规定的方法进行产气荚膜梭菌带菌量的测定。结果显示,个体乳样产气荚膜梭菌的分离率为11.3%(7/62),且全部为A型菌,57.1%(4/7)的分离菌株携带atyp.cpb2基因,但所有分离菌株均未检测到cons.cpb2和cpe基因。而混合乳样(24份)中未分离出目的菌。场3的28份乳样中3份产气荚膜梭菌阳性乳的带菌量为1 CFU/mL～15.3 CFU/mL。初步了解了陕西关中地区生鲜牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况、血清型及其携带的毒素基因,为关中地区牛奶中该菌污染的防控提供科学依据,为该菌引起食物中毒的流行病学研究提供参考资料。     

携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究

为验证重组α毒素对携带非典型cpb2基因的A型产气荚膜梭菌的免疫保护性,本研究应用PCR技术,从某牛场牛源A型产气荚膜梭菌G1分离株中扩增出1 194 bp的α毒素编码基因(cpa)和795 bp的β2毒素编码基因(cpb2)。经BLAST分析显示,G1分离株携带的cpb2基因与14个菌株的非典型cpb2基因的氨基酸序列同源性为95.1%～98.9%,与典型cpb2基因(L77695)的氨基酸序列同源性为61.7%。这表明,G1的cpb2基因为非典型cpb2基因。同时分别将cpa和cpb2基因扩增产物克隆于原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-a和pET-b2,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,将其纯化后单独及联合免疫小鼠进行免疫保护试验。结果显示,单独免疫重组α毒素蛋白组以及联合免疫重组β2毒素蛋白组的小鼠,均可以抵抗至少6倍最小致死量(MLD)的G1外毒素(包含α毒素和非典型β2毒素)的攻击,也可以完全抵抗至少6 MLD的G2外毒素(不包含β2毒素)的攻击。表明,重组α毒素蛋白对含有及不含有非典型β2毒素的A型产气荚膜梭菌均具有良好的免疫保护作用。     

鹿出血性肠炎病原菌的分离和鉴定

通过对死于出血性肠炎的圈养鹿的病原菌进行分离鉴定,为研制产气荚膜梭菌β-毒素单价和多价疫苗奠定基础。采集山西省内不同地区鹿场因出血性肠炎而死亡鹿的病料32例,经病原微生物分离培养、生化试验和血清型鉴定,分离得到C型产气荚膜梭菌,并测定分离菌所产毒素对小鼠的最小致死量。PCR扩增C型产气荚膜梭菌β-毒素基因,构建重组质粒p MD18-T-J28-C,进行酶切鉴定和核苷酸序列分析。结果 32株分离菌中有6株是C型产气荚膜梭菌,占18.7%;其余均为A型,占81.3%。筛选出毒力最强的菌株J28-C,最小致死量(MLD)为5.0×105CFU/m L。PCR扩增和核苷酸序列分析表明,经PCR得到了特异性的β毒素基因片段。表明造成山西省鹿出血性肠炎的病原菌为A型和C型产气荚膜梭菌,以A型为主。     

多重聚合酶链反应检测环境中产气荚膜杆菌

产气荚膜杆菌根据产生4种主要毒素（α－β、ε、τ－毒素）可分为5种类型A－E型。在该研究中依据产气荚膜杆菌的5种毒素基因的序列，设计了5对PCR引物，建立了多重PCR方法，该方法可以快速区分5种类型的产气荚膜杆菌。并对68份环境样品（生活污水、生物肥料）进行检测和基因分型，共检出55株产气荚膜杆菌，其中A型产气荚膜杆菌50株，占总数的90％以上，B型、C型、D型只占5％，未检出E型产气荚膜杆菌，所有的分离株没有发现带有肠毒素。结果表明，目前环境中主要存在的菌型为A型菌，其他菌型的产气荚膜杆菌很少，而多数是非致病性产气荚膜杆菌。     

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。     

多重PCR方法快速检测粪样中产气荚膜梭菌

建立了多重聚合酶链反应 (multiplexPCR)检测产气荚膜梭菌的α_毒素和肠毒素 (enterotoxin)基因。该方法可以检测猪粪便样品或小肠内容物中肠毒性产气荚膜梭菌。首先猪粪便样品经前处理后 ,接种选择性培养基 ,再挑取单个菌落溶于超纯水中 ,煮沸提抽 ,制备样品DNA ,进行PCR检测。从实验中我们成功的扩增出 32 4bp的α毒素基因片段和 2 33bp的肠毒素基因片段。以人工污染样品 10倍系例稀释后进行检测 ,该方法的检测灵敏度达到 1.0× 10 4 CFU/g并对 5 8份猪粪便样品检测 ,获得 5 3株产气荚膜梭菌 ,分离率为 91%,其中 4株为带有肠毒素的产气荚膜杆菌 ,占整个分离菌株的 7.5 %。因此多重PCR方法在检测粪样中的产气荚膜梭菌是一种非常有用的方法并可以快速检出肠毒素 ,从而避免了使用动物作定型试验。     

商品肉鸡梭菌性肠炎的试验诊断

为了对商品肉鸡梭菌性肠炎的发病情况进行调查,本试验对收集的不同养殖模式的具有肠炎症状的肉鸡肠道内容物进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定、活菌计数、菌株毒素类型鉴定以及动物试验,并对其中的43株分离株进行了药敏试验,同时也对不同宿主来源的14株产气荚膜梭菌进行了16S rRNA基因的同源性分析。结果显示,患病鸡肠道分离到的产气荚膜梭菌均为A型且肠道内容物活菌数量达10~6CFU/g以上;动物试验结果显示,攻毒菌液上清的小鼠在观察期内死亡并表现出明显的坏死性肠炎症状;药敏试验结果表明,不同来源菌株耐药性存在差异;同源性分析发现,不同宿主来源的14株产气荚膜梭菌无明显宿主特异性。本试验结果可为临床肉鸡梭菌性肠炎的了解及防治提供一定的参考价值。     

不同来源产气荚膜梭菌分离株的分子和表型特征

由于欧盟减少使用促进生长的抗生素，诱发肠炎和亚临床疾病的产气英膜梭菌成为禽类健康的重要威胁。比利时科研人员研究了来自不同健康状况的禽群产气英膜梭菌分离株的基因型和表现型特征。健康禽群用泄殖腔拭子取样，感染坏死性肠炎的禽群从肠道和肝脏取样。从23群无临床症状的禽群得到27个分离株，从8个出现临床症状的禽群分离到36个细菌株。采用脉冲凝胶电泳法分型，结果显示来自不同禽群的分离株之间存在高度的基因差异性。所有分离株都属于A型毒素株。5／35个脉冲凝胶电泳样品的分离株包含cpb2基因，编码β-2毒素，2／35的分离株包含cpe基因编码肠毒素。采用ELISA体外定量分离株的α毒素产量，结果表明病群分离株的α毒素产量高于健康群分离株。     

餐厨废水中A型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

为了对餐厨废水中的产气荚膜梭菌进行鉴定,试验采用TSC培养基进行厌氧培养、显微镜检等常规方法进行分离,并提取细菌基因组,设计、合成产气荚膜梭菌α、β、ε与ι毒素基因引物,配制PCR反应体系并设置反应条件,对扩增产物进行电泳检测。结果表明:分离菌在TSC培养基上产生黑色菌落,经琼脂糖凝胶电泳只有α毒素基因得到良好扩增。说明此次分离菌为A型产气荚膜梭菌。     

羊源产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α,β,ε,ι毒素基因序列,设计并合成4对特异性引物,经过优化多重PCR反应条件,建立了检测产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而对诺维氏梭菌和腐败梭菌扩增为阴性;灵敏性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0,17.8,12.2,13.8,18.5pg;重复性试验表明,该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测出9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本试验建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。     

多重PCR检测产气荚膜梭菌方法的建立及其临床应用

产气荚膜梭菌是牛羊猝死和肠出血症的重要病原之一。本研究根据其常见的A、B、C、D四种菌型菌株编码α、β和ε毒素的保守序列,分别设计合成了针对这3种毒素的特异性引物,建立了多重PCR检测不同血清型产气荚膜梭菌的技术方法。通过对参考菌株的分型检测表明,该方法不仅快速、客观,而且具有良好的特异性和敏感性。对羔羊猝死症中分出的菌株进行检测,确定其为产气荚膜梭菌A型和D型混合感染;对产后母牛血痢病料中分离的菌株进行检测确定其为产气荚膜梭菌A型。