云南地区牛源无乳链球菌分离鉴定及毒力基因和耐药性的检测

试验旨在研究无乳链球菌的生物学特性,为防治无乳链球菌引起的奶牛乳房炎提供理论依据。根据细菌分子生物学分离鉴定无乳链球菌,参考GenBank登录的牛源无乳链球菌16SrRNA、菌属特异性cfb(CAMP因子)、毒力基因和耐药基因序列,运用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0软件设计14对引物,建立PCR快速检测方法,并进行20种常见抗生药物的耐药试验。结果显示,试验成功鉴定出17株牛源无乳链球菌,毒力基因与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性,均≥99%;共检测到6种耐药基因;分离菌株对青霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素、万古霉素、氨苄西林、新生霉素、磺胺异噁唑的耐药率均较高,耐药率依次为100.0%、94.1%、94.1%、94.1%、94.1%、82.3%、82.3%和47.1%,对青霉素严重耐药;而对氨基糖苷类、四环素类、头孢菌素类、喹诺酮类耐药率均较低,耐药率分别为15.7%、14.7%、7.7%和3.9%。本研究结果表明,建立的PCR快速检测方法灵敏可靠,云南地区无乳链球菌已对部分β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类等抗生素出现多重耐药性。     

广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析

本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性,为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。本研究于2019—2020年,从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。用PCR方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测,通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究,利用斑马鱼模型进行了致病性试验。结果显示：从261份病样中分离到35株无乳链球菌;血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ia型;主要毒力基因的检测证明,cylE、sodA、gapC基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100%,而scpB只在人源参考菌株中检出;药敏试验结果发现,无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90%以上,对6种抗菌药耐药率为50%以上,分离株的耐药基因型和表型部分一致,无乳链球菌分离株均多重耐药,其中5重及以上耐药的菌株为27株,占总菌株数的77.1%;斑马鱼致病试验表明,无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性,为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。     

福建省漳州市罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及毒力基因和耐药性研究

【目的】 明确福建漳州地区罗非鱼无乳链球菌临床分离株的血清型、毒力基因携带情况与耐药特性,为鱼源无乳链球菌研究提供新的数据。【方法】 于福建省漳州市部分罗非鱼养殖场采集疑似无乳链球菌感染的病鱼样品,通过分离培养、形态观察及生化试验初步分离鉴定病原菌。经由16S rDNA特异性片段引物、16S rDNA通用引物进行PCR鉴定及测序比对鉴定分离株。用PCR方法检测分离株血清型及4个主要毒力基因（cylE、sodA、gapC和scpB基因）分布情况。通过纸片扩散法对分离菌株进行11大类共29种抗菌药物的药敏试验,并进行多重耐药分析。【结果】 分离株菌落呈白色圆形、边缘整齐、表面光滑湿润,呈β溶血;革兰染色阳性,菌体排列为长短不一的链状,单个或成对存在;VP试验、CAMP均为阳性,触酶试验阴性,能发酵海藻糖,均符合无乳链球菌的典型特征,经鉴定共分离获得14株鱼源无乳链球菌。14株分离菌株的血清型均为Ⅰa型。分离株毒力基因cylE、sodA、gapC的检出率均为100%,而毒力基因scpB均未检出。分离菌株对磺胺异噁唑、庆大霉素、卡那霉素耐药率均为100%,对链霉素、新霉素、甲氧胺嘧啶耐药率均>70%。分离株均为多重耐药菌株,6重及以上耐药的菌株占总分离菌株数的78.57%。【结论】 本研究明确了当前福建漳州地区罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因和耐药特性,为进一步研究鱼源无乳链球菌的致病机理和临床有效防控措施提供参考。     

广西罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定、毒力基因及耐药性研究

本研究旨在明确中国罗非鱼主养区广西各地罗非鱼无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）分离株的血清型分布、毒力基因携带情况和耐药情况,为罗非鱼无乳链球菌病的防控奠定基础。2018-2019年从广西柳州、钦州、南宁、北海等地患无乳链球菌病罗非鱼体内分离了47株无乳链球菌,并对各分离株的血清型、毒力基因分布和耐药情况进行检测和分析。血清型检测结果表明,47株无乳链球菌血清型高度一致,均为Ⅰa血清型。对4种毒力基因检测结果表明,47株无乳链球菌临床分离株cylE、sodA、gapC毒力基因的检出率均为100%,而scpB基因仅在人源参考菌株2603V/R中检出,在所有鱼源分离株中未检出。对11类（31种）常见抗生素的药敏试验结果表明,临床分离株对磺胺异噁唑、新霉素、庆大霉素、卡那霉素的耐药率达到90%以上,对氧氟沙星、左氧氟沙星、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、土霉素、强力霉素的敏感性均为100%。多重耐药检测结果表明,5重以上耐药菌株占93.62%,其中9重以上耐药菌株为19.15%,且均分离自柳州地区。结果表明,广西地区罗非鱼源无乳链球菌血清型单一,均为Ⅰa血清型,且均携带多种毒力基因,多重耐药现象严重。     

内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌毒力基因检测及耐药性研究

为了解内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌毒力基因的分布情况及其耐药现状,通过该地区360份乳房炎奶样链球菌的分离鉴定,利用微量肉汤稀释法测定了81株链球菌对15种药物的MIC,采用PCR法检测耐药基因及毒力基因的携带情况。结果显示,分离到的81株链球菌对β-内酰胺类的耐药率最高;对红霉素和四环素的耐药率在40%~85%;对氟喹诺酮类的耐药率相对较低。多重耐药菌株达88.9%(n=72)。耐药基因pbp2b的检出率为86.4%,tetL和tetM的检出率在75%以上,红霉素耐药表型主要由ermB介导。分离菌株毒力基因中cfb的检出率最高(50.6%),其次为cyl和hylB。内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类和四环素耐药情况严重,且发现多重耐药菌株的流行;链球菌中尤以无乳链球菌的毒力基因携带率较高。     

海南牛乳源链球菌的分离鉴定及特性分析

为调查海南地区奶牛场链球菌的感染情况,本研究对2017年海南澄迈地区某奶牛场收集的67份牛乳样品,经培养基分离、生理生化分析和16S rRNA基因测序,结果显示共检测链球菌感染样品20份,其中乳房链球菌感染样品16份,巴氏链球菌感染4份。乳房链球菌分离株的耐药性检测结果显示,分离株对氨基酸糖苷类抗生素的耐药性最高,其次是四环素类、多肽类和利福霉素类。多重耐药菌株占68.75%(11/16);对11种毒力基因PCR扩增结果显示,除lbp外,其余10种毒力因子在各分离株中的存在率均为100%。以上研究表明,海南奶牛主要受乳房链球菌感染,而非报道最多的无乳链球菌;该乳房链球菌耐药性强、毒力因子发生频率独特,提示可能与海南特殊的生态环境、饲养以及用药措施等相关。本研究首次对海南牛源链球菌进行了鉴定及分析,为该病原防治提供了依据。     

华北地区部分省(市)奶牛乳房炎乳中链球菌耐药表型和耐药基因研究

为了解华北地区4个省(市)奶牛乳房炎乳中链球菌的感染情况及对常用抗生素的耐药性,试验采用EN液体培养基、5%绵羊鲜血琼脂培养基、触酶试验、6.5%NaCl试验、七叶苷试验、马尿酸钠试验和CAMP试验对2016年华北地区240批次乳房炎奶牛乳样进行链球菌的分离鉴定和分型;采用纸片扩散法对2016年华北地区分离出的链球菌进行药敏试验,对华北地区上下半年及4个省(市)链球菌的药敏情况进行对比;并通过PCR扩增技术研究链球菌的耐药基因,计算链球菌表型耐药率与所携带相关耐药基因的阳性率,比较两者的相符率。结果表明:共分离得到致病性链球菌28株,总分离率为11.67%,其中无乳链球菌7株、停乳链球菌5株和乳房链球菌16株;链球菌分离株对苯唑西林和青霉素G表现出完全耐药;对四环素类药物耐药性较高,强力霉素和四环素的耐药率分别为85.71%和82.14%;对氯霉素类药物高度敏感,敏感率为92.86%;对喹诺酮类和氨基糖苷类药物耐药性较低,平均耐药率分别为8.93%和10.20%;除磺胺类药物外,其他类药物耐药率下半年均低于上半年;在4个省(市)中,天津市链球菌分离株对各类抗生素的平均耐药率高于其他省(市);经PCR扩增检测,耐药基因阳性率在7.14%～26.79%之间,整体检出率较低,耐药基因与耐药表型相符率在0～100%之间,其中氯霉素相符率为0,并不能完全拟合。说明2016年我国华北地区链球菌总检出率较低,乳房链球菌为主要致病菌,链球菌分离株表现出不同程度的耐药性,且多为多重耐药,耐药基因与耐药表型的相符率较低。     

宁夏地区牛源肠球菌分离鉴定及耐药性与毒力基因检测

为了了解宁夏地区牛源肠球菌的耐药性及耐药基因和毒力基因的携带情况,本试验使用显色培养基及PCR法对肠球菌进行分类鉴定;采用药敏纸片琼脂扩散法(K-B法)测定肠球菌对16种抗菌药物的敏感性;最后采用PCR方法对9种相关耐药基因与7种肠球菌毒力基因进行检测并测序。结果显示,在分离鉴定出的255株肠球菌中,屎肠球菌有78株(30.59%),粪肠球菌有53株(21.96%)。药敏试验结果显示,分离菌对磺胺异恶唑和杆菌肽耐药率达到了100%;其次是苯唑西林(92.16%)、红霉素(65.88%)、四环素(65.49%)和青霉素(56.86%)。分离菌对万古霉素和利奈唑胺高度敏感,敏感率分别为92.54%与95.29%。耐药基因检测结果显示,氨基糖苷类耐药基因aph(3)′-Ⅲ的检出率最高,为100%;其次是红霉素类耐药基因ermB,为46.27%;未检出耐万古霉素耐药基因VanA、VanB、VanC。已检测的毒力基因明胶酶gelE的携带率最高,为37.60%;其次为心内膜炎抗原efaA,为36.10%。结果表明,宁夏地区牛源肠球菌的多重耐药现象比较严重,应当加以重视。     

无乳链球菌耐药性及耐药基因检测

为了解昆明地区奶牛隐性乳房炎无乳链球菌分离株对常用抗生素的耐药性及耐药基因携带情况,采集昆明某地区隐性乳房炎患牛乳样71份检测。结果显示,分离到的15株无乳链球菌,对青霉素类、红霉素、林可胺类等抗生素存在不同程度的耐药现象,多重耐药现象也比较严重,分离菌共出现10种耐药谱,其中7耐和8耐的占有60%。对青霉素严重耐药,其耐药率达到了100%。其中,PCR扩增β-内酰胺类和大环内酯类耐药基因,结果显示,15株无乳链球菌均含有pbp1a、pbp2b、erm B基因,表明,本地区不能继续使用青霉素等药物来治疗奶牛乳房炎,应选择敏感性的药物,如头孢类抗生素等。同时应合理交叉用药,以防细菌产生耐药性。本试验为昆明地区无乳链球菌引起的隐性奶牛乳房炎的防治提供了一定的依据。     

海南罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

为探究目前海南地区罗非鱼无乳链球菌病的流行性,了解该地区无乳链球菌耐药情况,本研究2020年8月从海南地区部分渔业养殖场的病鱼中共分离获得15株无乳链球菌,对各分离菌株的血清型、主要毒力基因及耐药性进行检测,并对多重耐药情况进行分析。血清型检测结果显示,15株分离菌株的血清型与对照菌株A909一致,均为Ⅰa型。毒力基因检测结果显示,15株分离菌株均未检出毒力基因scpB,但该毒力基因在参考菌株人源无乳链球菌2603V/R中检出,而主要毒力基因cylE、sodA、gapC的检出率均为100%。药敏试验结果表明,15株分离菌株对甲氧胺嘧啶、磺胺异噁唑、复方新诺明、链霉素、新霉素、庆大霉素的耐药率达85%以上;对头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、卡那霉素、红霉素、利福平、克林霉素敏感性达80%以上;未发现对甲氧胺嘧啶、氟罗沙星、链霉素、新霉素、庆大霉素敏感的菌株。多重耐药检测结果表明,15株分离菌株均至少对4种药物表现耐药,其中6重及以上耐药的菌株占总分离菌株数的86.67%,并有2株为13重耐药菌株。本研究为海南地区鱼源无乳链球菌病的用药提供参考,为华南地区罗非鱼无乳链球菌的流行病学和疾病防控提供调查依据。     

一株羊源致病性屎肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

试验从甘肃肃南县某羊场死亡羊中分离出疑似某球菌菌株XCP,为进一步确定该致病菌株及其耐药性情况,进行了病原菌分离、革兰氏染色、生化试验、16S rRNA PCR扩增鉴定、小鼠致病力试验、药敏试验、毒力基因和耐药基因扩增试验研究。结果发现,该菌革兰氏染色阳性,高盐、蜜二糖、蔗糖等生化反应阳性,VP、马尿酸盐、阿拉伯糖等生化反应阴性;16S rRNA基因PCR扩增后,进行BLAST比对,结果与GenBank中的屎肠球菌16S rRNA基因序列同源性为100%;小鼠致病力试验发现,该菌株具有很强的致病性;该菌株对β-内酰胺类抗生素苯唑西林、青霉素G,喹诺酮类抗生素诺氟沙星、环丙沙星、左氟沙星,以及四环素等高度耐药,对红霉素、万古霉素、克林霉素等抗生素敏感;毒力基因Asal、cylA、acm和耐药基因TetM、ant（6）-Ⅰ、aac（6'）-aph（2"）、ermB扩增均为阳性。结果表明,该菌为屎肠球菌（Enterococcus faecium）,具有较强的致病性和耐药性,可能与毒力基因和耐药基因的高阳性率有关。     

Isolation,Identification and Drug Resistance Analysis of Pathogenic Enterococcus feacium of Sheep

To further identify the pathogenic strains and analyze their antibiotic resistance, the methods of pathogen isolating, the methods of Gram staining, biochemical tests and 16S rRNA PCR amplification, virulence tests, drug sensitive tests, virulence genes and resistance genes PCR amplification were used. The results showed that the strain was Gram-positive and revealed positive after reacting with 6.5% NaCl, melibiose, sucrose and etc., while revealed negative reactions with VP, hippurate, arabinose and etc.. It showed 100% similarity with Enterococcus feacium 16S rRNA gene sequence in GenBank after PCR amplification of 16S rRNA gene and BLAST alignment. It was found severe pathogenicity after virulence tests in mice. The strain was highly resistant to oxacillin, penicillin G of β-lactam antibiotics and norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin of quinolones antibiotics and tetracycline, while was sensitive to antibiotics of erythromycin, vancomycin and clindamycin. It revealed that virulence factor genes Asal, cylA, acm and resistance genes TetM, ant(6)-Ⅰ, aac(6')-aph (2"), ermB showed positive. The results showed that the bacteria was Enterococcus feacium, it had a strong pathogenicity and severe drug resistance, which might be related to the highly positive rates of virulence genes and drug resistance genes.     

广西猪源产肠毒素大肠杆菌毒力因子及多重耐药性分析

本研究旨在探究广西某猪场可能存在的病原菌及其致病的主要原因。试验采用细菌分离纯化、形态学鉴定、生长曲线测定、生化分析及药敏试验等进行细菌的分离鉴定,应用PCR技术对菌株16S rRNA、毒力基因及耐药基因进行检测。结果表明,该由病料分离的菌株为无芽孢、有菌毛、两端钝圆的粗短杆状的革兰氏阴性菌,其繁殖能力强、生长迅速,疑似为大肠杆菌。16S rRNA扩增结果显示,出现大小为1 474 bp的条带,测序结果表明其与大肠杆菌的同源性可达99%。该菌株对31种常见抗菌药物表现出极强的耐药性,对庆大霉素、替米考星、四环素、恩诺沙星、青霉素、林可霉素、磺胺甲噁唑等均呈现较高的耐药水平,耐药率高达87.10%(27/32),仅对阿米卡星、黏菌素2种药物敏感。毒力因子检测共鉴定致病岛FyuA、肠毒素STb和LT及黏附素F41和K88共5种毒力因子,检出率为35.70%(5/14)。扩增出β-内酰胺酶类bla_TEM和bla_OXA、四环素类tet(A)、磺胺类Sul2、氨基糖苷类aadA1和aac(3′)-Ⅱa、喹诺酮类GyrA、GyrB和ParC及氯霉素floR共10种耐药基因,检出率为66.70%(10/15),且耐药基因的检出与耐药表型呈正相关。综上,该菌株含多种毒力因子,耐药型复杂,多重耐药性情况严重,需采取相应的预防措施,防止蔓延和传播。     

沙门菌19个毒力岛标志性基因的PCR检测

建立沙门菌19个毒力岛标志性基因检测方法,了解沙门菌中毒力岛的分布情况。通过比对验证挑选出45个毒力基因作为19个毒力岛标志性基因,建立PCR检测方法,并对伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌进行分布情况研究。19个毒力岛上45个标志性基因分别在伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌得到验证,PCR扩增产物与预期扩增产物一致,电泳条带典型,无非特异扩增条带及杂带出现。45个标志性基因在伤寒、肠炎、鼠伤寒及贝坎道夫沙门菌检出率分别为75.56%、75.56%、66.67%和42.22%。本研究建立的45个毒力岛标志性基因检测方法具有结果准确、简单快速、费用低廉等优点,适用于沙门菌毒力岛研究及不同来源的沙门菌致病性风险评估。     

Detection and Analysis of Virulence Genes and Drug Resistance Genes in E. coli Strains Isolated from Dairy Cows with Clinical Mastitis in Liaoning Region

In order to understand the virulence genes and drug resistance genes carried by E.coli strains from dairy cows with mastitis in large-scale dairy farms in Liaoning region, and also provide improved programs for control and treatment of mastitis to dairy farmers, 66 strains of E.coli isolated from milk of dairy cows with clinical mastitis in several large-scale farms in Liaoning region were examined to detect 4 virulence genes and 4 drug resistance genes using PCR methods. The results showed that none of the target genes was detected in only one strain, while at least 2 and up to 7 target genes were detected in the rest of 65 strains. The detection rates of the virulence genes stx2e, eaeA, K99 and astA were 56.1%, 47.0%, 34.8% and 31.8%, respectively. In addition, the detection rate of dual virulence gene reached 43.9%, in which the genotype with the highest detection rate was eaeA/stx2e. The detection rates of the drug resistance genes sul3, sul1, cmlA and aacA4 were 87.9%, 83.3%, 40.9% and 28.8%, respectively. And the dual resistance gene detection rate was 36.4%, in which the highest detection rate was sul1/sul3 genotype; Triple drug resistance gene detection rate was 37.9%, and cmlA/sul1/sul3 presented the highest detection rate. These results confirmed that the E.coli isolated from dairy cow mastitis in large-scale dairy farms in Liaoning region had high detecting rates of sulfonamide resistance genes and chloramphenicol resistance genes, which was directly related to the drug resistance of the E.coli. These results provided important guiding significance for the prevention and control of dairy cow mastitis in Liaoning region as well as the safety of public health.     

辽宁地区奶牛乳房炎源大肠杆菌毒力基因及耐药基因检测分析

为了掌握辽宁地区规模奶牛场乳房炎源大肠杆菌携带的毒力基因和耐药基因,为奶牛养殖业提供更好的乳房炎防制方案,本研究采用PCR检测方法对辽宁地区多个规模奶牛场临床奶牛乳房炎奶样中分离的66株大肠杆菌进行了4种毒力基因和4种耐药基因的检测分析。结果发现,66株大肠杆菌中仅有1株未检出相关目的基因,其余65株中最少检出2种目的基因,最多检出7种目的基因。其中,毒力基因stx2e、eaeA、K99和astA的检出率分别为56.1%、47.0%、34.8%和31.8%,双重毒力基因的检出率达到43.9%,以eaeA/stx2e基因型的检出率最高;耐药基因sul3、sul1、cmlA及aacA4的检出率分别为87.9%、83.3%、40.9%和28.8%,双重耐药基因的检出率为36.4%,以sul1/sul3基因型检出率最高;三重耐药基因的检出率为37.9%,以cmlA/sul1/sul3检出率最高。本研究结果证实,辽宁地区奶牛乳房炎源大肠杆菌携带磺胺类耐药基因和氯霉素类耐药基因的比率较高,与大肠杆菌的耐药性有较直接的关系,该结果对于辽宁地区奶牛乳房炎的防制具有重要的指导意义,更具有重要的公共卫生意义。     

京津冀部分地区致犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因、耐药基因检测及药物敏感性分析

【目的】探明京津冀地区犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因与耐药基因流行情况,筛选敏感药物。【方法】于2020年12月至2021年7月从京津冀地区部分牛场采集146份犊牛腹泻样本,通过细菌分离纯化、革兰氏染色镜检及16S rRNA测序进行大肠杆菌分离鉴定;采用PCR方法对分离菌进行毒力基因（F17、K99、F41、STa、stx1、irp2和fyuA基因）和耐药基因（aac（6'）-Ⅰb、bla_CTX-M、bla_TEM、OqxB、tetA和sul1基因）检测;采用K-B纸片法进行药物敏感性试验。【结果】分离菌在鉴别培养基上的生长形态及革兰氏染色镜检结果均符合大肠杆菌生理生化特性,分离菌16S rRNA测序结果呈单一峰值,对拼接序列在NCBI中进行BLAST比对后发现,与大肠杆菌相似性均>96%,确定分离菌为大肠杆菌。试验共分离鉴定大肠杆菌142株,其中有88株携带毒力基因,占61.97%（88/142）,毒力基因F17、K99、F41、STa、stx1、irp2、fyuA阳性率分别为24.65%、0.70%、0、2.11%、1.41%、45.07%和21.83%,其中F17、irp2、fyuA为优势毒力因子,同时携带多重毒力因子的大肠杆菌检出率较低。aac（6'）-Ⅰb、bla_CTX-M、bla_TEM、OqxB、tetA和sul1 6种耐药基因皆被检出,bla_TEM基因检出率最高,为45.77%,aac（6'）-Ⅰb和OqxB基因检出率最低,均为9.15%,分离菌株主要携带1~3种耐药基因。药物敏感性试验结果显示,142株分离菌对诺氟沙星敏感率最高,其次为环丙沙星,对青霉素敏感率为0,耐药现象严重,耐2种以上抗菌药物的菌株达86.62%。【结论】京津冀地区犊牛腹泻大肠杆菌毒力基因与耐药基因流行广泛,耐药普遍,多重耐药现象严重。本研究可为京津冀地区犊牛腹泻的防治提供理论依据。     

新疆北疆地区猪源粪肠球菌的耐药性分析

为了解新疆北疆地区猪源粪肠球菌的耐药性及相关耐药基因型的分布情况,本试验采用K-B（Kirby-Baller）琼脂扩散法检测了49株猪源粪肠球菌对8种抗菌药物的敏感性,并采用PCR法对9种相关耐药基因进行检测并测序,测序结果与GenBank中的相应基因序列比对。药敏试验结果显示,分离菌对链霉素耐药率最高,其次为青霉素和红霉素,对呋喃妥因、氨苄西林高度敏感。PCR检测结果显示,β-内酰胺类耐药基因tem的检出率最高,为93.88%,其次是四环素类耐药基因tetM,为85.71%,喹诺酮类基因gyrA和parC检出率均为42.86%,氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-Ⅲ、aac（6'）/aph2″和ant（6'）-Ⅰ的检出率分别为36.73%、16.33%和16.33%,未检出mefA和ermB基因。本试验从表型与基因型分析发现,北疆地区猪源粪肠球菌的多重耐药现象非常严重,且其耐药表型与基因型并不完全一致。     

Development and Application of Multiplex PCR Method for the Drug Resistance Genes Detection in Avian Pathogenic Escherichia coli

To detect the drug resistance genes, the multiplex PCR method for drug resistance genes of β-lactams, tetracyclines, aminoglycosides, amphenicols, and sulfonamides were developed. Based on the sequences of drug resistance genes from GenBank, 17 pairs of specific primers were designed. Then, 4 multiple PCR assays were established through the optimization of PCR reaction conditions and primers concentrations (cat+floR+tetB+tetC; dfrA12+sul2+sul1+bla_CTX-M+bal_TEM-1; aac3+aph3+aadA1+strB; tetA+cmlA+strA+sul3). The sensitivity and specificity of these assays were determined. The multiplex PCR assays were used to detect the drug resistance genes of 42 avian pathogenic Escherichia coli (APEC). The drug sensitivity of these APEC strains were also determined, which were compared to the distributions of drug resistance genes in these strains. The results showed that the 17 drug resistance genes were effectively and specifically amplified in these 4 optimized multiplex PCR assays. The detection limits of the 4 multiplex PCR were 10³, 10⁴, 10⁴ and 10⁵CFU of bacteria, respectively. The established multiplex PCR assays are specific and rapid for the detection of drug resistance genes in APEC strains, which showed 92.86% coincident with the drug resistance for these strains. The developed 4 multiplex PCR are simple and rapid assays for drug resistance genes detection, which can be used for the epidemiologic study for drug resistance genes.     

常见耐药基因多重PCR方法的建立及用于禽致病性大肠杆菌耐药性监测

本研究旨在建立β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物耐药基因的多重PCR检测方法，用于耐药基因的快速检测。根据GenBank公布的上述5类抗菌药物的耐药基因序列，设计17对特异性引物。通过优化PCR体系和反应程序，建立4组耐药基因（cat+floR+tetB+tetC；dfrA12+sul2+sul1+bla_CTX-M+bal_TEM-1；aac3+aph3+aadA1+strB；tetA+cmlA+strA+sul3）的多重PCR反应体系。然后，检测多重PCR方法的特异性和敏感性。利用建立的多重PCR方法检测42株禽致病性大肠杆菌的耐药基因，同时，检测其耐药性，比较分析耐药基因和耐药表型之间的相关性。结果显示，建立的4组多重PCR体系可有效扩增出17个耐药基因片段，测序结果表明特异性较好。敏感性结果表明，4组多重PCR体系的菌液敏感性分别为10³、10⁴、10⁴和10⁵CFU。禽致病性大肠杆菌分离株的耐药基因多重PCR和单重PCR检测结果一致，其携带的耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。本研究建立的耐药基因多重PCR方法能简便、快速地检测常见的耐药基因，可用于耐药基因的传播、流行调查。