dsRNA介导的PRSV-CP基因3＇-端同源序列瞬时表达对番木瓜环斑病毒侵染的影响

体外合成我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白（PRSV-CP）基因3＇-端278bp同源区段,构建包含278bp正义链、内含子（PDK内含子）及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,直接转化根癌农杆菌EHA105。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究同源dsRNA对番木瓜环斑病毒（PRSV）侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的dsRNA能够特异地干扰PRSV侵染。     

dsRNA介导的PRSV-CP基因3''-端同源序列瞬时表达对番木瓜环斑病毒侵染的影响

体外合成我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白(PRsv-CP)基因3'-端278 bp同源区段,构建包含278 bp正义链、内含子(PDK内含子)及278 bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,直接转化根癌农杆菌EHA105.通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究同源dsRNA对番木瓜环斑病毒(PRSv)侵染的干扰作用.结果表明,瞬时表达的dsRNA能够特异地干扰PRSV侵染.     

农杆菌浸润瞬时表达分析番木瓜miR162a的研究

农杆菌浸润瞬时表达方法不仅在蛋白互作、鉴定基因沉默抑制子及基因功能研究方面得到广泛应用,目前还应用在小RNA的研究中.在对植物microRNA的研究中,农杆菌浸润方法通过将将转基因导入农杆菌浸润本生烟瞬时表达,可以快速、稳定地对植物microRNA进行检测和鉴定,样品在几天内就可分析完成,比获得稳定遗传的转基因有优势.笔者借鉴国外拟南芥microRNA瞬时表达分析的方法,克隆了番木瓜的miR62a前体序列连接到双元表达载体pSuper1300上构建成35S::cpa-miR162a质粒,导人农杆菌GV3101后浸润本生烟,浸润后48 h提取本生烟叶片总RNA后通过miRNA northern blot检测到miR162a,而本生烟和番木瓜自身则无法检测到低丰度的miR162a.本文介绍的农杆菌浸润瞬时表达方法能够在体外加工产生成熟的miRNA,该技术有助于对microRNA的结构-功能的相关性及靶标验证进一步研究.     

Patatin、Wun1启动子驱动的PPO反义基因植物表达载体的构建

以植物表达载体PC3-ASPPOty为基础,分别构建了由Patatin、Wun1启动子调控的PPO反义基因植物表达载体pCP-ASPPOty、pCW-ASPPOty,并通过直接导入法将重组质粒分别导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为获得地上部分PPO活性正常、块茎损伤低褐化的马铃薯加工型改良品种奠定了基础。     

番木瓜β-Gal基因的克隆分析与植物表达载体构建

番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近,与鳄梨和北美云杉则较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了β-Gal基因启动子,初步验证了其果实表达特异性。将该启动子替换载体p2301/TTRG上的CaMV 35S启动子,构建出RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测结果表明,载体p2301/BPTTRG已被成功导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。     

Patatin启动子驱动的人胰岛素原基因的植物表达载体的构建

使用马铃薯的偏爱密码子设计合成人胰岛素原基因,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,构建由patatin启动子调控的人胰岛素原基因植物表达载体p1301Ph,并将导入根癌农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定证明,此基因已整合到农杆菌Ti上。表达载体的建立为日后转基因工作奠定了基础。     

PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达及其在番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系中诱导RNA沉默的研究

为探索利用PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达产物在体外防治番木瓜环斑病毒的可行性,利用较保守的PRSV-NIb基因3’端的312、501和809 bp区段分别构建了含有PDK内含子的3个发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jml09LacY分别作为宿主载体和宿主菌构建了高效的dsRNA原核表达工程菌M-Jml09LacY/pSP73-RNAi-N312、M-Jml09LacY/pSP73-RNAi-N501、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N809,经IPTG诱导成功表达了dsRNA,并证明dsRNA不被DNase I和RNase A降解,稳定性较好.还利用PRSV-NIb基因构建了GFP瞬时植物融合表达载体pNIb-GFP,对经3种dsRNA和GFP瞬时融合表达载体共转化的番木瓜叶片原生质体的共聚焦显微镜观察及通过半定量RT-PCR对其中mRNA表达量的分析,结果表明融合基因NIb-GFP的表达均发生了不同程度的下调,说明dsRNA在原生质体中引发了针对同源基因的沉默.     

无机焦磷酸化酶基因的克隆与植物表达载体的构建

提取面包酵母基因组DNA,用无机焦磷酸化酶(PPase)基因特异引物通过PCR扩增出864bp的片段,并将该片段克隆至pMD18-T上。序列分析结果表明,该克隆序列与GeneBank上的PPase基因序列同源性达到100%。进一步将叶肉细胞特异性启动子rbcS和PPase基因克隆至植物表达载体pCBI上,构建了由rbcS启动子调控的PPase基因植物表达载体pCBIPR。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,为农杆菌介导的PPase基因对植物的遗传转化奠定基础。     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料,利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段,将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序,结果证明,此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBIFe,并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

大豆凝集素基因Le2克隆及转化

大豆凝集素对提高植物的抗虫性有重要作用.应用基因工程手段,克隆大豆凝集素基因Le2,构建植株表达载体pSy-Le2,将大豆凝集素Le2基因通过农杆菌介导法导入烟草中,经过筛选获得转基因植株,为进一步鉴定Le2的基因功能提供了试验基础.     

玉米淀粉分支酶基因的克隆和反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列.结果表明:克隆片段全长为1 698 bp.将该基因反向插入到pCAMBIA1301的CaMV35S启动子之后,构建了反义表达载体.     

灰树花gpd-GF启动子的克隆与表达载体的构建

根据已经报道有强启动子活性的香菇gpd启动子设计引物,从灰树花基因组PCR扩增获得大小分别为1018,615bp的2个片段gpd-GF1和gpd-GF2,通过DNA序列测定得知二者的大小分别为1018,615bp,经NCB1中的BLASTN比较,gpd-GF1,gpd-GF2与已报道的香菇中克隆的gLeGPD基因上游序列的同源性分别为96%,98%,通过启动子预测软件分析,结果表明,gpd-GF1和gpd-GF2含有多个顺式作用元件如TATA box,GAtA box,CAAT box等,初步证实 gpd-GF1,gpd-GF2可能有较强的启动子活性。将gpd-GF1,gpd-GF2分别与切除CaMV35S启动子的pCAMB1A1301大片段进行亚克隆,构建成表达载体pCBgpdGF1和pCBgodGF2。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

巴西橡胶树CBF1基因的克隆和序列分析

通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了CBF基因家族的保守区,并通过5＇端RACE和3＇端RACE技术克隆了全长为1121 bp的cDNA序列,通过BLAST工具搜索Genbank数据库.结果表明,该cDNA序列同其他植物中的CBF家族基因高度同源,认为该cDNA序列就是橡胶树中的CBF基因.利用genescan和ClastalX工具对该序列进行分析,推测其编码区为693bp,编码231 Aa,并包含一个AP2 DNA结合域.氨基酸同源性分析结果表明,来自橡胶树的CBF基因氨基酸序列与热带起源的作物同源性较高,而与北方种植作物相似性较低.     

小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因。最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨。     

水稻稻曲病菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

水稻稻曲病是由稻绿核真菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak]引起的一种常见的水稻后期穂部病害。G蛋白可能参与了稻曲病菌的致病过程。为了研究G蛋白在病菌致病过程中的作用,分离并分析了稻曲菌的G蛋白β亚基编码基因。根据丝状真菌G蛋白β亚基编码基因的同源保守序列设计简并引物,采用同源克隆和热不对称交错PCR的方法,分离得到了稻曲菌的G蛋白β亚基全编码基因序列。该序列的长度为2037bp,包含4个内含子,5个外显子和1个编码359个氨基酸的开放阅读框。根据克隆到的UvGβ1设计引物,通过RT-PCR克隆到包含整个开放阅读框的cDNA序列。该基因的DNA序列和cDNA序列在GenBank中注册的登记号分别为GU014921和GU065745。系统进化分析表明该片段与栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的G蛋白β亚基基因亲缘关系最近。将该基因的整个开放阅读框连接于pET-30a构建原核表达载体,通过诱导获得了重组蛋白。     

Controlled expression of cholera toxin B subunit from Vibrio cholerae in Escherichia coli

The ctxB gene, the causative agent of cholera epidemic was successfully cloned from V. cholerae in E. coli. The insertion of the gene was confirmed by PCR as well as restriction digestion analyses. The sequencing results for the gene confirmed that the insert was in the correct orientation and in-frame with the P(BAD) promoter and it showed that the gene was 99% homologous to the published ctxB sequence. The CTB protein was successfully expressed in E. coli using the pBAD/His vector system. The expected protein of approximately 14 kDa was detected by SDS-PAGE and Western blot. The use of pBAD/His vector to express the cholera toxin gene in E. coli would facilitate future study of toxin gene products.     

龙眼体胚Myb转录因子基因的克隆及序列分析

以龙眼同步化调控的鱼雷形胚为材料,设计特异上下游引物,采用RT-PCR法,获得了797 bp的基因序列。通过NC-BI的BLAST软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性搜索及相似度分析,结果表明,所获得的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列与其他物种的Myb转录因子有较高的同源性,推断该基因序列属于龙眼Myb转录因子基因。已在GenBank登录,登录号为HQ661039。