卡瓦胡椒的研究进展

通过阐述卡瓦胡椒的植物形态、生态学特性、化学成分、药理作用、种质资源情况和分子标记研究、栽培方法研究及加工方法研究,提出我国卡瓦胡椒今后的主要研究方向,为今后卡瓦胡椒的研究提供指导。     

华山新麦草2Ns染色体SCAR标记的开发

为准确快速地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,利用180条长度为10 bp的随机引物R1~R180对小麦-华山新麦草全套（1Ns~7Ns）二体附加系及其亲本华山新麦草和普通小麦7182共9个材料进行了RAPD分析。结果表明,R131在华山新麦草和小麦-华山新麦草2Ns二体附加系中可以扩增出特异条带。将该特异条带回收并测序,发现其全长为1 126 bp,对其进行序列比对分析后设计SCAR引物S131,然后利用S131重新对9份材料进行了SCAR分析。结果显示,S131只在华山新麦草和小麦-华山新麦草2Ns二体附加系中扩增出特异性条带,表明RAPD标记R131已成功转化为可靠、特异的SCAR标记S131。这个新的SCAR标记可用于检测普通小麦背景下华山新麦草2Ns染色体。     

基于TRAP的长穗偃麦草SCAR标记的开发及应用

为了开发长穗偃麦草的特异标记,依据TRAP技术,利用56对固定引物与随机引物的组合对中国春-长穗偃麦草附加系等材料进行PCR扩增,共筛选出160条分布于长穗偃麦草1E-7E染色体的特异扩增片段。通过对104个片段的序列进行同源比对,选择与小麦无同源序列的区段设计138对引物,分别对中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草附加系进行PCR扩增,最终获得30个长穗偃麦草特异SCAR标记,发展标记的效率为53.6%。利用这些特异SCAR标记对硬粒小麦(AABB)与异源六倍体小麦(AABBEE)杂交产生的F2中38个单株进行扩增鉴定,9个单株仅附加了1条相同的E染色体,其余为多条E染色体或者无E染色体附加。这些SCAR标记在不同材料和世代表现出优越的特异性和稳定性,可用于检测小麦背景中附加的相关长穗偃麦草染色体。     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子、双因子实验研究了胡椒ISSR-PCR反应体系中热参数和5个主要成分,即退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间以及Mg2+、dNTPS、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶对扩增结果的影响,建立了适合胡椒ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25 μL反应体系中,内含2 mmol/L Mg2+、200 μmol/L dNTPS、1×PCR Buffer、2 μmol/L引物、100 ng模板、1 U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性3 min, 94℃变性120 s,复性60 s,72℃延伸 3 min,循环35个,结束后72℃延伸7 min。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行胡椒种质鉴定、遗传多样性分析奠定了基础。     

海南胡椒属植物资源形态多样性聚类分析

在胡椒属植物中,栽培胡椒具有很高的经济价值,野生胡椒资源也具重要的开发价值。为了解海南胡椒属植物的遗传多样性,本研究采集了74份材料,对其形态性状进行了多样性分析。结果表明,所研究的28个形态性状其平均变异系数为51%。数量性状中,侧枝长度的变异系数最大,为91%,叶片宽的变异系数最小,为46%;质量性状中,主蔓被毛指数变异系数最大,为170%,成熟叶片颜色指数的变异系数最小,为9%。采用数量分类法对海南胡椒属植物的种质资源多样性进行了形态聚类分析,在阈值为0.139处,74份胡椒种质被分为3大类群;在阈值为0.032处,74份胡椒种质可分成SG1(所有的海南蒟)、SG2(6份假山蒟)、SG3(6份假山蒟和3份华南胡椒)、SG4(8份假山蒟和4份细叶青蒌藤)、SG5(假蒟和蒌叶)、SG6(印尼大叶种、班尼叶尔一号和古晋种3个栽培品种)、SG7(9份大叶蒟和2份复毛胡椒)和SG8(16份毛蒟和1份苎叶蒟)8个亚类。     

小麦 黑麦大粒1BL/1RS易位系的分子细胞学鉴定

为明确小麦 黑麦大粒衍生系14 1 2的遗传组成,综合采用细胞学、基因组原位杂交(GISH)、SCAR标记、SSR标记对该衍生系进行鉴定。黑麦基因组特异SCAR标记鉴定表明,14 1 2含有黑麦遗传物质;有丝分裂和减数分裂中期Ⅰ染色体数目为2n= 42=21Ⅱ。以黑麦基因组为探针的GISH检测表明,14 1 2含有2个黑麦染色体臂。黑麦7条染色体上的特异标记鉴定表明,只有黑麦1RS上的特异SCAR标记在14 1 2中扩增出黑麦特异条带。小麦7个部分同源群染色体长短臂上的SSR引物鉴定表明,只有1BS上的4对引物在14 1 2中未扩增出1BS的条带,其余染色体上的引物均扩增出了相应条带。由此证实小麦1BS被黑麦1RS所替代,衍生系14 1 2为1BL/1RS易位系材料。     

胡椒EST-SSR标记的开发和应用

通过分析NCBI数据库中胡椒转录组数据,共得到unigene 23 524条,其中618条unigene中检测到643个EST-SSR位点,SSR发生频率为2.63%,平均分布距离为12.86 kb。在643个EST-SSR中,二、三核苷酸重复是主要重复类型,分别占27.84%和69.36%,其中(AG/CT)n、(AAG/CTT)n出现频率最高,(NNN/NNN)5类型占EST-SSR位点的42.90%。利用PRIMER3.0设计358对引物,随机合成45对引物,并选用其中11对扩增较好的多态性引物,对43份胡椒种质的遗传多样性进行初步检测,构建聚类分析树状图。结果说明,胡椒EST-SSR标记的开发是可行的,并能够有效的用于胡椒遗传分析研究,具有较高的应用价值。     

小麦 黑麦大穗型衍生后代的分子细胞学鉴定

为创制大穗型小麦种质材料,利用具有大穗多小穗性状的小麦-黑麦双二倍体材料"兰小黑"和普通小麦杂交得到一批大穗型衍生后代.综合采用基因组原位杂交(GISH)、SCAR标记、微卫星(SSR)和醇溶蛋白(A-PAGE)技术对这些大穗型后代中的8个单株进行分子细胞学鉴定.结果表明,GISH检测后代含2个外源信号;1RS特异SCAR标记检测后代均含有黑麦1.5 kb的1RS特征条带;醇溶蛋白检测后代都出现了黑麦碱基因Sec-1特征条带.筛选小麦21条染色体长短臂上各6对引物,结果发现只有1BS上的3对引物未扩增出1BS的条带,其余引物均扩增出了各自的相应条带.由此确定这8株小麦-黑麦大穗型衍生后代为1BL/1RS易位材料.     

小麦秆锈菌生理小种21C3CTH SCAR标记的建立

为了建立中国小麦秆锈菌流行小种的分子检测标记,利用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)技术对我国小麦秆锈菌6个主要生理小种21C3CTH、21C3CPH、21C3CFH、34MKG、34C2MKK和34C2MKR进行了分析,筛选特异性片段并将其转化为SCAR(Sequence-characterized amplified region)标记。在156条10碱基随机引物中,引物S92(5′-CAGCTCACGA-3′)在小麦秆锈菌生理小种21C3CTH中扩增出一条782bp的特异片段,回收、克隆和测序该特异片段,根据特异片段的核苷酸序列设计了1对SCAR特异引物,经验证,该引物特异性良好。结果表明,小麦秆锈菌生理小种21C3CTH的RAPD标记被成功地转化为SCAR标记,这为该生理小种的分子鉴定和监测奠定了基础。     

华山新麦草3Ns染色体特异SCAR标记的开发

为快速准确地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,采用150条10bp的随机引物R1-R150对华山新麦草、普通小麦7182、中国春及华山新麦草1Ns-7Ns全套二体附加系共10个材料进行了RAPD分析,从中获得了华山新麦草3Ns染色体上2个特异RAPD分子标记片段FR-113和FR-125。克隆这两个片段并测序,发现其全长分别为543bp和515bp;分析序列后对其分别设计SCAR引物S-113和S-125,重新对10个材料进行SCAR分析,结果只在华山新麦草和小麦-华山新麦草3Ns二体附加系上扩增出了特异条带,由此证明已将华山新麦草3Ns染色体上获得的两个RAPD标记成功转化为稳定可靠的SCAR标记。这两个SCAR标记可用于检测小麦背景下的华山新麦草3Ns染色体,同时为小麦-华山新麦草杂交后代提供了分子鉴定依据。     

一个鉴别低温刺激型秀珍菇的ISSR-SCAR标记建立与应用

为了快速、准确地鉴别低温刺激型秀珍菇菌株,在对18个供试菌株进行拮抗试验、现蕾出菇试验、ISSR图谱分析的基础上获得了秀珍菇菌株的ISSR特异性标记,将其克隆、测序。根据测序结果,应用Primer 6.0软件设计SCAR引物进行引物筛选,获得1对引物并成功转化为低温刺激型秀珍菇的稳定SCAR标记。采用该引物对供试秀珍菇菌株的基因组DNA 进行PCR扩增,低温刺激型秀珍菇菌株均能扩增出大小为205 bp的特异性DNA片段。该ISSR-SCAR标记能快速、有效地鉴别出低温刺激型秀珍菇菌株,准确率达100%,为秀珍菇种质资源的鉴别和分类提供了技术支撑。     

甜椒脉斑驳病毒（PVMV）在海南的发现与检测

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到pMD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：该条带序列（包含部分NIb和部分cp基因）与已收录的甜椒脉斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）（GenBank登录号：FM202327）序列相似性最高,达99％。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明：海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07％,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。     

ACGM标记在小麦属中的通用性

为检验水稻基因组数据在小麦属中的通用性。利用基于水稻基因组数据设计的扩增共有序列遗传标记（ACGM）扩增小麦属12种不同材料，结果有32对引物可以至少在1种小麦属材料中获得扩增产物。占引物总数的80％；在能够获得特异性产物的32对引物中，有4对引物的产物在供试材料之间没有多态性位点；有28对引物可以在供试小麦材料之间获得多态产物，占引物总数的70％。这表明以水稻基因组序列开发的ACGM标记在小麦中有一定的通用性。     

台湾甜椒种子中辣椒轻斑驳病毒检测及其致病型鉴定

利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和基因序列分析法对一批台湾进境的辣椒种子进行病毒检测及致病型鉴定,同时使用特征序列扩增区域(SCAR)标记引物利用PCR方法对该辣椒品种进行L抗性基因检测。DAS-ELISA及RT-PCR结果表明,从该批种子中检测到辣椒轻斑驳病毒(Peppe rmild mottle virus,PM MoV)。PCR产物测序分析表明,该序列为PM MoV的外壳蛋白(CP)基因,与已报道的PM MoV序列同源性为92.4%～99.8%。CP蛋白氨基酸序列分析表明,该分离物(命名为TW分离物)属于PM MoV的P1,2,3致病型。抗性基因检测表明,该辣椒品种携带有L3抗性基因。TW分离物能够系统侵染该辣椒品种,意味着该分离物已经克服L3基因介导的抗性。本研究报道的PM MoV的P1,2,3致病型在中国大陆尚属首次,这对于抗病辣椒品种的选育具有重要的指导意义。     

小麦抗叶锈基因 Lr20、 Lr28、 Lr29的STS、SCAR标记在近等基因系上的特异性验证

为了把特异性分子标记与抗病性鉴定有效地结合起来,用含有不同抗叶锈基因的54个以Thatcher为遗传背景的近等基因系（Nearisogenic lines,NILs）对与抗叶锈基因 Lr20、 Lr28和 Lr29（ Lr29UBC和 Lr29OPY）连锁的STS、SCAR标记进行特异性验证,结果分别扩增出片段大小依次为540、378、1 000、900 bp的条带,与报道片段大小一致。同时发现与抗病基因 Lr20、 Lr29连锁的STS分子标记及与 Lr29连锁的两个SCAR标记 Lr29UBC、 Lr29OPY在NILs中特异性较好,但 Lr28的PCRSTS Lr28扩增产物不仅在其亲本中,而且在其余53个近等基因系中都扩增出与报道大小相同的378 bp的条带。验证结果表明,与抗病基因 Lr20、 Lr29连锁的STS、SCAR分子标记在NILs中特异性较好,可方便地用于小麦抗叶锈的分子标记辅助选择育种,而 Lr28的STS分子标记没有特异性,不能用于分子标记辅助选择育种。     

Development and Application of SCAR Markers for Discriminating Cytoplasmic Male Sterile Lines from Their Cognate Maintainer Lines in Indica Rice

The DNA fragments about 1 600 bp were amplified using random amplified polymorphism DNA (RAPD) primer OPA12 with the templates of mitochondrial DNA of Zhenshan 97A and Zhenshan 97B,and were sequenced.The nucleotide sequences and lengths of the fragments from Zhenshan 97A and Zhenshan 97B showed no difference.The precise length of the fragment was 1 588 bp.Sequence characterized amplification region (SCAR) primers were then developed to discriminate the cytoplasmic male sterile (CMS) lines and their maintainer lines.A specific 1 588 bp fragment could be amplified with SCAR primers,CHI19F2/CHI19R2 and CHI20F3/CHI23R3,in the mitochondrial DNA of Zhenshan 97A,but not Zhenshan 97B.Furthermore,the specific fragment could be also amplified from the total DNA from green leaf tissues of Zhenshan 97A with SCAR primers,but not Zhenshan 97B.With the corresponding primers,the specific fragment could also be amplified from the total DNA of green leaves of other two CMS lines with wild abortive type cytoplasm (CMS-WA),namely Zhenpin A and Tianfeng A,but not in their maintainer lines.Moreover,using total DNA as template,each of the four pairs of SCAR primers could also be used to amplify the 1 588 bp fragment in CMS-ID (Indonesia paddy type) line Ⅱ-32A,but not in II-32B,and the specific fragment was amplified from the DNA of both F1 and F2 seedlings of Shanyou 63.The results of detecting the genetic purity of a man-made mixture of the seeds of Zhenshan 97A using CHI20F3/CHI23R3 were completely consistent with the phenotypes.Taken together,these results indicated that the specific 1 588 bp-fragment amplified by CHI20F3/CHI23R3 was the unique amplification products of CMS mitochondrial DNA,and could be used to distinguish CMS-WA and CMS-ID lines from their corresponding maintainer lines at the seedling stage.     

咖啡种质资源DNA指纹图谱的构建

选用4份咖啡种质资源为材料,对S1-S100共100个RAPD引物进行筛选,选出多态性好的引物10个。利用这10个RAPD引物对28份咖啡资源进行扩增,共获得86条带,平均每个RAPD引物扩增出8.6条带,多态性谱带74条,多态性条带比率为86.0%。结果表明：供试咖啡种质资源遗传多样性较丰富;10个多态性好的RAPD引物中S8的鉴别效率最高,能将全部供试材料全部区分开,通过整合软件录入如所属种类、种质名称、采样地点、引物、RAPD-PCR 扩增数据以及电泳图片等相关信息,形成指纹图谱二维编码,构成咖啡种质资源的DNA指纹图谱,为咖啡种质资源品种权益保护及分子身份证构建奠定了基础。     

Evaluation of genetic diversity in turmeric (Curcuma longa L.) using RAPD and ISSR markers

Turmeric (Curcuma longa L.) is an industrially important plant used for production of curcumin, oleoresin and essential oil. In the present study we examined the genetic diversity among turmeric accessions from 10 different agro-climatic regions comprising 5 cultivars and 55 accessions. Two DNA-based molecular marker techniques, viz., random amplified polymorphism DNA (RAPD) and inter simple sequence repeat (ISSR) were used to assess the genetic diversity in turmeric genotypes. A total of 17 polymorphic primers (11 RAPDs and 6 ISSRs) were used in this study. RAPD analysis of 60 genotypes yielded 94 fragments of which 75 were polymorphic with an average of 6.83 polymorphic fragments per primer. Number of amplified fragments with RAPD primers ranged from 3 to 13 with the size of amplicons ranging from 230 to 3000 bp in size. The polymorphism ranged from 45 to 100 with an average of 91.4%. The 6 ISSR primers produced 66 bands across 60 genotypes of which 52 were polymorphic with an average of 8.6 polymorphic fragments per primer. The number of amplified bands varied from 1 to 14 with size of amplicons ranging from 200 to 2000 bp. The percentage of polymorphism using ISSR primers ranged from 83 to 100 with an average of 95.4%. Nei's dendrogram for 60 samples using both RAPD and ISSR markers demonstrated an extent of 62% correlation between the genetic similarity and geographical location. The result of Nei's genetic diversity (H) generated from the POP gene analysis shows relatively low genetic diversity in turmeric accessions of South eastern ghat (P7), Western undulating zone (P8) with 0.181 and 0.199 value whereas highest genetic diversity (0.257) has been observed in Western central table land (P9). Knowledge on the genetic diversity of turmeric from different agro-climatic regions can be used to future breeding programs for increased curcumin, oleoresin and essential oil production to meet the ever-increasing demand of turmeric for industrial and pharmaceutical uses.     

栽培大豆品种间RAPD标记的多态性分析及聚类分析

应用从６０００多份大豆种质资源中筛选的２１个抗大豆花叶病毒病的品种或品系及７个感病的品种或品素,选用２０个随机引物,对总ＤＮＡ进行了随机扩增。有１８个引物扩增得得到了稳定的ＲＡＰＤ图谱。ＯＰＨ－０６和ＯＰＨ－１０未能扩增到ＲＡＰＤ产物。