河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查

为调查乳仔猪腹泻引起疫情的病原,本研究自2011年2月至2012年3月收集华东地区47个规模猪场共153份腹泻病料样品,采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒(PEDV),并进行ORF3基因序列分析.结果显示:26个猪场的88份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到55.32％,病料阳性率达到57.52％.ORF3基因测序分析显示:11个流行病毒株ORF3全基因序列大小均为675bp,编码224个氨基酸.11个流行株ORF3基因同源性为95.9％～99.9％,编码氨基酸同源性为96.4％～100％.与欧洲代表性强毒株CV777基因同源性为96.3％～97.0％,编码氨基酸同源性为95.1％～96.4％,与CV777弱毒疫苗株基因同源性为96.8％～97.6％,编码氨基酸同源性为92.3 ％～93.4％,并且无疫苗病毒株ORF3基因的49个碱基缺失.与韩国病毒株比较,其基因同源性为95.0 ％～98.5％,编码氨基酸同源性为95.5％～99.6％.基因遗传进化树分析表明,国内外PEDV株可分为4群.我国主要流行病毒株属于第1群,与韩国病毒袜亲缘关系较近,而与我国疫苗病毒株存在较大差异.该研究表明,PEDV可能是目前我国仔猪腹泻的主要病原之一,我国PEDV流行病毒株存在明显基因变异.     

我国华东地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异分析

为了确定猪流行性腹泻病毒的流行特点及变异规律,本研究对我国华东地区分离到的14株PEDV的ORF3基因进行了克隆和序列测定,并与国内外代表毒株的ORF3基因进行了比较分析。结果表明:我国华东地区检测的PEDV流行毒株的ORF3基因之间的同源性为92.4%~100%,与经典毒株CV777同源性为92.0%~96.4%,与PEDV变异株的同源性为95.1%~100%。根据ORF3基因的遗传进化分析,分离的14个PEDV毒株与CV777的遗传进化距离较远,与PEDV变异株的遗传进化距离较近,表明我国PEDV流行毒株以变异株为主,较以往的疫苗株CV777发生了较大的变异,因此需要开发新的疫苗,制定更具针对性的防控措施。     

猪流行性腹泻病毒ORF3基因云南株的克隆及序列分析

为了解云南省与贵州省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ORF3基因变异情况,试验采用PCR技术、分子克隆及序列分析方法对云南省昆明市某规模化养猪场发生腹泻的6头病猪的粪便病料样本进行了研究。结果表明:1株PEDV ORF3基因均含有964个碱基,编码320个氨基酸;ORF3基因均无碱基缺失或插入,存在部分碱基变异;与GenBank中登录的部分PEDV核苷酸序列的同源性为95.1%~99.9%,推导氨基酸序列的同源性为94.2%~98.7%;与经典毒株CV777及贵州毒株GZZY、GZMR、GZZAI1亲缘关系较近,与贵州(GZTW3、GZRRH)毒株亲缘关系较远。说明云南省与贵州省主要流行的毒株同源性较高且存在一定相关性。     

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪“顽固性腹泻”疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析.结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7％～100.0％,氨基酸的同源性为94.7％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7％,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0％.M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8％～100.0％,氨基酸的同源性为94.8％～99.6％,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8％,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0％.4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远.     

粤北地区新生仔猪腹泻病原学调查及PEDV ORF3基因分子特征和遗传变异分析

为了解粤北地区新生仔猪腹泻病的主要病原,本试验采用实时荧光定量RT-PCR方法对2015年粤北地区6个规模化猪场31份新生仔猪腹泻样品进行了猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)检测,并对5株PEDV流行毒株ORF3基因进行测序分析。病原检测结果显示,83.87%(26/31)样品为PEDV阳性,没有检测到TGEV和PoRV阳性样品。对PEDV ORF3基因序列分析结果显示,5个流行毒株ORF3基因全长均为675bp,相互之间核苷酸同源性为98.7%~100.0%,与参考序列同源性为94.5%~100.0%,多个核苷酸位点发生了共同突变。系统进化树分析结果表明,PEDV可分为两个基因群,粤北地区流行的PEDV与2013-2015年间在中国部分地区、东南亚、北美洲和欧洲流行的PEDV遗传关系较近,位于基因1群中的同一个亚群,而2011-2012年中国流行的PEDV主要毒株及疫苗毒株则归类于另外两个基因亚群。结果表明,粤北地区新生仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,PEDV基因随着时间推移呈现不断进化和变异趋势。     

5株猪流行性腹泻病毒流行株的遗传变异分析

为了解当前猪流行性腹泻流行情况,对4个地区疑似PEDV S1、ORF3基因进行RT-PCR扩增,并对5株PEDV流行株进行核苷酸同源性及遗传进化分析。S1基因核苷酸同源性比较与进化分析显示,5株PEDV流行株与意大利Italy/69979-25株、美国OH851株、我国主要变异株W-pintung-52株、AH2012、JXGZ2013等位于同一进化分支,其核苷酸同源性达98%以上。ORF3基因核苷酸同源性比较与进化分析发现,5株PEDV流行株均属于野毒株,与Tottori/JPN/2014变异株亲缘关系较近,其核苷酸同源性高达98.8%～100%。提示当前猪流行性腹泻病毒仍以变异株为主。     

吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

贵州省部分PEDV流行株ORF3基因克隆与遗传进化分析

为探究贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传进化情况,对2017—2022年贵州省不同地区13份PEDV阳性腹泻样本进行ORF3全基因扩增、克隆、测序,使用DNAstar、MEGA 7.0软件,对所得序列核苷酸和氨基酸同源性以及突变和遗传进化情况进行分析。结果显示：13份PEDV阳性样品的ORF3基因序列全长均为675 bp,编码224个氨基酸;13条克隆序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%～100%和96.4%～100%;13条克隆序列与经典毒株CV777株ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%～97.3%和94.7%～96.4%,同源性较低;与经典毒株CV777株相比,13条克隆序列在G160A、C243T、C274T、G301A、C450T、A497G存在相同的核苷酸突变,存在4个相同的氨基酸位点突变(V21A、V54I、A101T、N166S);13条克隆序列所在毒株在遗传进化上全部属于GⅡ型,其中GZ220514、GZ342、GZ224、GZ219、GZ423隶属于GⅡb亚型,GZ210112、GZ210129、GZ210220、GZ210714、...     

6株猪流行性腹泻病毒贵州株S基因序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。     

2011—2012年四川省猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析

为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本试验从四川省11个市19个不同地区发生仔猪腹泻疾病的猪场采集的病料中分别扩增到8个PEDV(SC-8)ORF3和部分S基因序列,将其进行比对和遗传演化分析。结果显示,SC-8的ORF3基因包含674~676个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的国内外地方流行株的核苷酸序列同源性为95.7%~99.9%,氨基酸序列同源性为98.2%~100%,与标准毒株CV777相比,核苷酸序列和氨基酸序列除存在点突变现象外,部分序列还存在核苷酸的插入和缺失性突变;部分S基因扩增长度为981bp,编码327个氨基酸,与国内外参考毒株的核苷酸序列同源性为93.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为93.5%~100%,与标准毒株CV777相比,四川-绵阳(SCMY)分离株在92~93nt之间存在1个核苷酸插入,在2~29aa之间也有18个氨基酸发生了突变;系统进化树分析表明,8株PEDV ORF3基因均与野毒株亲缘关系较近,而与弱毒疫苗株亲缘关系较远;SC-8的部分S基因均与国内地方流行毒株亲缘关系较近,而与国外分离株的亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒河南分离株全基因扩增及序列分析

为进一步了解我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)的分子流行病学特征,从阳性病料中分离得到1株河南毒株(命名为HeN17-2011),设计13对引物,对分离株HeN17-2011的基因序列进行RT-PCR扩增和全基因组3′Race、5′Race扩增,通过产物回收、转化和测序,经生物软件拼接,成功获得其全基因序列,并与近十几年的流行毒株进行了序列比对分析。结果显示:分离株HeN17-2011基因组全长为28 038 bp(不含polyA尾),基因组结构为5′UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3′UTR,与PEDV基因组的结构特征相符;通过与GenBank中已发表的国内外毒株ZJCZ4、CV777、DR13等26株PEDV序列进行比对发现,HeN17-2011与NW8的同源性最高为99.4%,与标准株CV777、韩国毒株DR13(JQ023161.1)和DR13(JQ023162.1)、美国毒株Illinois261、意大利毒株PEDV-1842-2016-ITA的同源性分别为96.9%,97.7%和97.3%,99.2%,98.7%,与SD-M的同源性最低为96.4%;PEDV分离株HeN17-2011与标准株CV777、韩国毒株DR13处于不同的分支上,遗传关系较远,属变异毒株,但与我国的流行毒株CH-SCZY103-2017、NW8等遗传关系较近;通过对全基因组序列分析发现,我国PEDV流行株在ORF1b、ORF3、E基因、M基因和N基因上的长度是保守的,它们虽然均存在点突变,但没有碱基的插入和缺失,我国流行株基因组长度变化主要与5′UTR、ORF1a、S基因、ORF3和3′UTR的碱基插入、缺失密切相关。     

猪流行性腹泻病毒山东SD20BZ01株的分离鉴定及遗传进化分析

为了解山东省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）基因组遗传演化特征,将山东省滨州市某猪场的PEDV阳性样品接种Vero E6细胞,结果成功分离到1株PEDV,将其命名为SD20BZ01株。通过RT-PCR分段扩增病毒基因组,经测序、拼接获得SD20BZ01株全基因组序列,并将其与GenBank收录的参考毒株序列进行同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,SD20BZ01株与我国2010年以来流行的GII-b亚群变异株序列同源性为97.8%~98.7%,明显高于CV777、DR13、SM98、SD-M等早期经典毒株,因此SD20BZ01属于GII-b亚群变异株。基于S基因的遗传进化关系与基于全基因组序列的遗传进化关系基本一致。与CV777株相比,SD20BZ01株S蛋白在中和抗原表位COE处有10个氨基酸突变,与近年来变异株S蛋白的氨基酸序列基本一致,说明GII-b亚群PEDV的变异规律逐渐趋于稳定。本研究为山东省PEDV流行病学研究及其流行控制策略的制定提供了理论依据。     

陕西省部分地区PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遗传变异分析

为了解陕西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传和变异情况,对9份疑似感染PRRSV的病料用RT-PCR方法分别扩增ORF3和ORF5基因,并进行测序和序列分析。测序结果表明,ORF3基因在254-490和646-737位置之间发生不连续碱基突变;与GenBank已发表的国外毒株ORF3基因组比较,同源性为89.2%~94.8%,与国内发表的ORF3基因比较,同源性为88.8%~99.0%,其中与2009年陕西分离株(HQ843181.1)同源性为94.9%~98.7%,与2010年陕西株(KJ855518.1)同源性为94.9%~98.6%。ORF5基因突变主要在508-600碱基位置之间,与GenBank上已发表的国外毒株ORF5基因组比较,同源性为90.1%~92.1%,与国内发表的ORF5基因比较,同源性为89.6%~99.2%,其中与2009年陕西分离株(HQ843181.1)同源性为95.2%~98.4%,与2010年陕西株(KJ855518.1)同源性为95.2%~98.7%。ORF3和ORF5基因进化树中Wn-2、Ak-3和Tc-4毒株在同一个进化支上,之间亲缘关系近,Xy-1和Hz-5毒株分别在不同的进化分支上,与其他毒株遗传距离较远。陕西省PRRSV流行毒株的ORF5和ORF3基因组与国内PRRSV分离株相比较均有一定变异,且亲缘进化不完全相同。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

猪德尔塔冠状病毒变异株CHN-GX01-2018株全基因序列分析

为了解广西PDCoV流行毒株在猪群中的感染和流行特点,用设计的25对特异性引物从腹泻样本中检测获得1株PDCoV全基因组序列。结果显示,CHN-GX01-2018株基因组全长25 406 bp,与美国毒株比较存在3处基因缺失,分别位于ORF1a/1b第400～403aa、第756～759aa位置及S基因存在1个氨基酸的缺失。全基因组与S基因遗传进化分析结果显示, CHN-GX01-2018与代表株CHN-AH-2004(安徽株)同源性为97.4%。然而,同源性分析显示中国PDCoV株也存在不同的进化分支,表明PDCoV在中国猪群中不断进化。     

2006—2012年鲁豫冀地区15株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5/Nsp2基因的遗传变异分析

为研究鲁豫冀地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的遗传变异情况,对2006—2012年来自3省区发病猪场的42份样品进行PRRSV分离鉴定,并进行了生物学特性研究和PCR鉴定,结果显示先后分离到15株PRRSV。分别采用RT-PCR扩增其ORF5基因和部分Nsp2基因并测序,与GenBank中68个ORF5序列和40个Nsp2序列的推导氨基酸序列进行比对,遗传变异分析结果表明,15株分离株均属于美洲型毒株,其中13个毒株Nsp2基因推导的氨基酸序列均存在氨基酸的不连续缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列与JXA1株有较高的同源性(95.5%~97.5%);SDDY2007株与疫苗株RespPRRS MLV和VR2332株亲缘关系相近,处于同一个亚群中;而HN25-2009分离株Nsp2基因推导的氨基酸序列有30个氨基酸的特征性缺失,其ORF5基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析结果显示该分离株处于VR2332所在亚群(氨基酸同源性97.5%),具有一定特殊性。本试验结果表明,2006—2012年高致病性PRRSV是鲁豫冀地区的优势流行毒株,且存在疫苗毒株,3省区流行毒株间有一定遗传差异,但无明显地域特征。     

猪圆环病毒2型吉林分离株的全基因组序列分析

采用PCR扩增1株吉林新分离的PCV2-2017全基因组序列,经过测序拼接后进行了序列分析。毒株PCV2-2017基因全长1 767 bp,在GenBank上进行同源性比对,同源性在96%～99%之间;与法国株AF055394同源性可达99%,与美国株AF055391、四川株HM102350同源性最低,为96%。PCV2中ORF1编码Rep蛋白,核苷酸和氨基酸同源性达到99%,ORF1突变很小,相对保守;ORF2基因全长为702 bp,编码Cap蛋白,氨基酸同源性达94%～99%,核苷酸同源性与美国株比对,可达96%,与法国株和国内部分毒株同源性达99%,是变异主要发生部位,共有12处点突变;ORF3编码蛋白,核苷酸同源性高达100%,说明变异不大。基因的遗传进化分析表明,PCV2-2017吉林新分离株全基因组与法国株AF055394亲缘关系最近,同属于PCV-2b亚型;与AY322001、AB426905和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393毒株亲缘关系较远。