内皮素受体在不同毛色绵羊皮肤中的表达和定位分析

 【目的】研究内皮素受体A和B(endothelin receptor A and B, EDNR A and B)在绵羊皮肤中的表达与定位,以及在不同毛色中的差异比较,探讨其在绵羊毛色形成中的作用及其相关机制。【方法】以不同毛色的成年绵羊为研究对象(设黑色毛和白色毛两组),用RT-PCR法检测EDNR基因在不同毛色皮肤中的表达,并使用实时荧光定量PCR技术分析不同毛色绵羊皮肤EDNR基因的相对表达量,采用免疫组织化学法和Western blot法对EDNR在绵羊皮肤中的表达进行定位和定量分析。【结果】荧光定量PCR结果显示黑色绵羊中EDNRA的相对表达量是白色绵羊的1.2648倍,EDNRB的则是1.8248倍;Western blot结果显示,皮肤组织粗蛋白提取物中含有EDNR蛋白,且受体A在黑白两组皮肤中表达不显著(P＞0.05),受体B在黑色组的表达显著高于白毛组(P＜0.05);免疫组化实验结果显示,EDNR蛋白在两组皮肤的表皮和毛囊中均有表达,通过光密度分析,受体A在黑毛皮肤各处细胞中的表达显著高于白毛皮肤,受体B则在除毛根鞘之外的其它两处细胞中表达显著高于白毛皮肤(P＜0.05)。【结论】实验结果提示,EDNR参与绵羊皮肤黑素细胞的生成,且两受体作用效应存在差异。     

酪氨酸酶在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中的表达与定位

【目的】研究酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位,为揭示羊驼被毛颜色形成的机制奠定基础。【方法】采用半定量RT-PCR方法检测TYR mRNA在不同毛色羊驼皮肤组织中的相对表达量,采用免疫组织化学技术对TYR在羊驼皮肤中的表达进行定位。【结果】不同毛色羊驼皮肤组织中均有TYR基因mRNA的表达,有色被毛皮肤组织中TYR的基因mRNA表达量显著高于白色被毛组织的表达量;在有色被毛皮肤组织中,TYR阳性反应区主要集中于毛球部位,即毛根成形部;而白色被毛组织中,TYR阳性反应区主要位于毛根壶腹部及膨大部,即毛根永久部。【结论】综合分析TYR基因mRNA表达量及蛋白定位结果可知,TYR是成熟黑色素细胞的标记分子之一,羊驼毛色形成取决于成熟黑色素细胞在毛囊组织中的相对数量及分布部位。     

不同毛色巴什拜羊皮肤组织中LEF1、YWHAZ及WNT2基因差异表达

【目的】研究LEF1、YWHAZ及WNT2基因表达量与毛色之间的关系,为分析LEF1、YWHAZ及WNT2基因在Wnt/β-actenin信号通路中的分子机制奠定基础。【方法】采用随机选取黑色和白色被毛的巴什拜羊各8只,采集皮肤组织,通过定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)方法测定LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色巴什拜羊皮肤中的表达量,并与LEF1、YWHAZ及WNT2基因转录组测序结果的FPKM值进行双向验证。【结果】LEF1基因在黑色巴什拜羊皮肤组织相对表达量是(4.66±0.59),在白色巴什拜羊皮肤组织是 (0.43±0.15);WNT2基因在黑色巴什拜羊组织相对表达量是(7.35±0.77),在白色巴什拜羊皮肤组织是(0.36±0.11);YWHAZ基因在黑色巴什拜羊组织相对表达量是 (4.44±0.57),在白色巴什拜羊皮肤组织是(1.02±0.23)。LEF1、YWHAZ及WNT2基因的转录组数据的FPKM值与qRT-PCR结果趋势一致。【结论】LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色的巴什拜羊皮肤组织中均有表达。且LEF1、WNT2及YWHAZ基因在黑色绵羊皮肤中的表达量极显著高于白色绵羊皮肤(P<0.01),LEF1、WNT2及YWHAZ参与毛色的形成过程,可作为绵羊毛色潜在基因研究与毛色之间的相关性。     

滩羊毛色候选基因MC1R和TCF25的mRNA表达量定量分析

为了探究影响哺乳动物毛色的黑色素皮质受体-1基因(MC1R)和转录因子25基因(TCF25)与滩羊毛色的关系,本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对15只不同毛色滩羊(纯白、褐斑、黑斑)皮肤组织中MC1R基因和TCF25基因的mRNA表达量进行研究。结果显示,MC1R基因和TCF25基因在3种不同毛色滩羊中均有表达。MC1R基因在不同毛色滩羊皮肤组织中表达量为黑斑>褐斑>纯白,其中黑斑组极显著高于纯白组(P<0.01),显著高于褐斑组(P<0.05),褐斑组显著高于纯白组(P<0.05);TCF25基因在不同毛色滩羊皮肤组织中表达量为纯白>褐斑>黑斑,组间差异不显著(P>0.05)。试验表明了目的基因表达量与滩羊毛色间的关系,为今后滩羊毛色选育与品种改良提供参考。     

内皮素3对不同毛色绵羊黑色素细胞的影响

【目的】探索内皮素3(EDN3)对来源于不同毛色体外培养的黑色素细胞产生黑色素作用机制及差异的影响。【方法】体外培养不同毛色皮肤来源的黑色素细胞,通过MTT法检测不同细胞在EDN3影响下的增殖率,分别提取两种细胞的总RNA和总蛋白,总RNA经反转录合成c DNA,采用实时荧光定量PCR方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在m RNA水平相对表达量的影响,总蛋白通过Western blot方法检测EDN3对两种细胞内EDNRB、NRas及TYR在蛋白水平的表达量是否发生变化,结果均使用SPSS19.0软件进行差异显著性分析。【结果】MTT法测得EDN3对黑白两种来源的黑色素细胞的增殖均产生促进作用,实时荧光定量PCR结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB m RNA的相对表达量是正常细胞组的1.7992倍,NRas是正常细胞组的1.8536倍差异极显著(P0.01),但TYR m RNA的相对表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB m RNA的相对表达量是正常细胞组的2.2512倍,NRas是正常细胞组的1.3859倍,TYR是正常细胞组的15.5710倍差异极显著(P0.01);Western blot结果显示添加EDN3的白色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.0827倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.2936倍差异显著(P0.05),TYR蛋白表达量未发生明显变化;添加EDN3的黑色来源细胞内EDNRB蛋白表达量是正常细胞组的3.9800倍差异极显著(P0.01),NRas是正常细胞组的1.3658倍差异显著(P0.05),TYR是正常细胞组的1.8498倍差异显著(P0.05)。【结论】EDN3促进白色来源的黑色素细胞增殖但对色素合成的限速酶TYR未产生促进作用;EDN3促进黑色来源的黑色素细胞增殖并可能促进黑色素生成。     

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。     

新疆山羊皮肤组织中MC1R·Agouti和MITF基因的差异表达研究

[目的]研究MC1R、Agouti和MITF基因在不同毛色新疆山羊皮肤组织中的差异表达，为确定其与新疆山羊毛色形成的相关性提供依据。[方法]采用实时荧光定量PCR技术，检测3种不同毛色(白色、褐色、黑色)新疆山羊皮肤组织中MC1R、Agouti和MITF基因mRNA的表达差异。[结果]MC1R、Agouti及MITF基因mRNA在不同毛色新疆山羊皮肤组织中均有表达；MC1R、MITF基因mRNA在黑色新疆山羊皮肤组织中的表达量高于褐色和白色新疆山羊(P>0.05),Agouti基因mRNA在白色新疆山羊皮肤组织中的表达量显著高于褐色和黑色新疆山羊(P<0.05)。[结论]MC1R、Agouti和MITF基因对新疆山羊毛色形成有一定影响，为今后新疆山羊毛色选育与品种改良提供了参考。     

湖羊羔皮候选基因在不同花纹间的表达与毛囊发育特性关联的研究

【目的】研究5个候选基因在不同花纹组间的表达量与毛囊各指标的相关性,进一步了解候选基因与毛囊发育特性间的关联,筛选用于后期功能验证的基因。【方法】利用荧光定量PCR技术检测5个基因在不同组别间的表达量,结合组织学与显微观测技术,分析5个基因与毛囊发育间的关联。【结果】湖羊毛囊成群分布,湖羊大花、小花、中花多以3毛囊群居多,直径较大的为中心初级毛囊,直径相对较小的为侧部初级毛囊。湖羊大花与中花、小花初级毛囊直径呈极显著差异（P＜0.01）,小花与中花初级毛囊直径差异不显著（P＞0.05）。中花次级毛囊直径与大花、小花次级毛囊直径呈极显著差异（P＜0.01）,但小花次级毛囊直径与大花次级毛囊直径差异不显著（P＞0.05）。初级毛囊数大花、中花、小花间差异均不显著（P＞0.05）,但相同视野中大花初级毛囊数多于中花、小花。中花次级毛囊数与大花、小花次级毛囊数呈极显著差异（P＜0.01）,但大花、小花次级毛囊数差异不显著（P＞0.05）;MMP2基因在中花皮肤组织中的表达量与大花、小花分别呈极显著差异（P＜0.01）,在大花皮肤组织中的表达量与小花差异不显著（P＞0.05）;BMP7基因在大花皮肤组织中的表达量与小花呈显著差异（P ＜0.05）,在中花皮肤组织中的表达量与大花、小花分别差异不显著（P＞0.05）;SFXN1基因在小花皮肤中的表达量与大花、中花分别呈显著差异（P＜0.05）,在大花皮肤组织中的表达量与中花差异不显著（P＞0.05）。其余基因在3组个体间差异不显著;MMP2基因相对表达量与大花次级毛囊数呈显著正相关（P＜0.05）。BMP7基因相对表达量与小花初级毛囊直径呈显著正相关（P＜0.05）,与小花次级毛囊数呈极显著正相关（P＜0.01）,与中花初级毛囊直径、次级毛囊数呈显著负相关（P＜0.05）;SFXN1基因相对表达量与大花初级毛囊呈显著负相关（P＜0.05）,与小花初级毛囊直径、小花次级毛囊直径分别呈显著正相关及极显著正相关,与中花初级毛囊直径呈极显著负相关。在BMP7基因表达量相同情况下,小花初级毛囊直径比中花初级毛囊直径大,小花次级毛囊数比中花次级毛囊数多,这与切片结果相符。MMP2基因在表达量相同情况下大花毛囊数多于小花,中花最少,这与切片结果一致。此外,在SFXN1基因表达量相同情况下,小花毛囊直径最大,大花次之,中花最小,这虽与切片结果不相符,但大花、小花次级毛囊数相差很小,总体来说趋势相同,结果基本相符。其余基因虽与毛囊相关指标存在关联,但在大中小花组表达差异不显著,【结论】BMP7、MMP2、SFXN1三个基因可作为湖羊早期羔皮选育的重要候选基因。     

蛋清内注射三碘甲腺原氨酸对鸭出雏前后生长发育、血清中甲状腺激素水平及肝脏中D1和D3表达的影响

【目的】以金定鸭为研究对象,孵化前向蛋清内注射三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine,T3）,检测鸭出雏前后体重、胸浅肌重、血清中甲状腺激素（thyroid hormones,THs）水平的变化,分析肝脏中I型脱碘酶（deiodinases I,D1）和Ⅲ型脱碘酶（deiodinasesⅢ,D3）mRNA表达、蛋白水平及酶活性的变化,探究外源性T3对鸭出雏前后生长发育及肝脏中脱碘酶表达的影响。【方法】将200枚金定鸭种蛋随机分为对照组和试验组,在孵化前从蛋的锐端往试验组种蛋蛋清内注射100 μL含250 ng T3的生理盐水,对照组注射不含T3的100 μL生理盐水,两组种蛋在相同条件下同期孵化。在27胚龄和7日龄时,记录鸭的体重和胸浅肌重,采用放射免疫分析法检测鸭血清中T3和四碘甲腺原氨酸（thyroxine,T4）水平,利用实时荧光定量PCR检测鸭肝脏中D1和D3的mRNA表达,利用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测鸭肝脏中D1和D3蛋白水平及酶活性。【结果】在27胚龄和7日龄时试验组鸭的体重（P = 0.035,0.044）和胸浅肌重（P = 0.027,0.037）均显著高于对照组;试验组血清中T3和T4水平在27胚龄时与对照组之间差异不显著（P > 0.05）,而7日龄时均显著低于对照组（P = 0.040,0.040）;试验组鸭肝脏中脱碘酶mRNA表达量仅D3在7日龄时显著低于对照组（P = 0.040）;在7日龄时试验组鸭肝脏中D1和D3的蛋白含量和酶活性亦均显著低于对照组（P = 0.017,0.045;P = 0.013,0.039）。鸭出雏前后的胸浅肌重与血清中T3水平呈强的负线性相关（r = -0.431,P = 0.025）;血清中T3水平与肝脏中D3的mRNA表达呈极显著正向相关（r = 0.778,P = 0.005）,血清中T4水平与D1和D3的蛋白水平和酶活性均呈正线性相关（r = 0.685,P = 0.020;r = 0.662,P = 0.026;r = 0.710,P = 0.014;r = 0.705,P = 0.015）。【结论】蛋清内注射T3促进了鸭出雏前后生长发育,同时伴随着出雏后循环中THs水平的降低,肝脏中D1和D3的表达发生下调。     

玉米赤霉烯酮对断奶小母猪子宫形态学及热应激蛋白70分布和表达的影响

【目的】研究不同水平玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）对断奶小母猪子宫形态学和子宫内热应激蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）的阳性分布规律及mRNA相对表达量的影响。【方法】选择25-28日龄健康三元杂交（杜×长×大）断奶小母猪40头,产床上适应环境10 d后转入单体笼（0.48 m²）。根据日龄（35-38）和平均体重（14.01 ± 0.86 kg）,将40头试验小母猪分为4个处理,每个处理10个重复,每个重复1头猪。对照组（Control）饲喂基础饲粮,处理1（ZEA0.5）、处理2（ZEA1.0）和处理3（ZEA1.5）分别在基础饲粮基础上添加0.5、1.0和1.5 mg·kg^-1的ZEA（ZEA的测定值分别为0、0.52±0.07、1.04±0.03和1.51 ± 0.13 mg·kg^-1）,小母猪单笼饲养,自由采食和饮水,预饲期10 d,正式期35 d。试验结束前一天对小母猪禁食12 h,全部放血屠宰,打开腹腔后无菌条件下迅速切取一份子宫组织置于2 mL无RNA酶的冻存管中液氮速冻,而后转至-80℃冻存,检测HSP70的mRNA相对表达量,另切取子宫组织块迅速固定于Bouin’s液,待做组织切片检测子宫形态学的结构和HSP70的阳性分布规律。【结果】随着饲粮中ZEA水平的升高,子宫肌层和内膜明显增厚,子宫腺数量明显增多,子宫腺密度明显增大;子宫肌层和内膜厚度随着饲粮中ZEA水平的升高呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.001）线性升高,1.5 mg·kg^-1 处理的子宫肌层和内膜厚度显著高于1.0 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,1.0 mg·kg^-1处理显著高于0.5 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,0.5 mg·kg^-1处理又显著高于对照组（P＜0.05）。免疫组化结果显示,HSP70免疫阳性物质主要分布于子宫肌层平滑肌细胞、子宫腺上皮细胞、腔上皮细胞和血管内皮细胞的胞质内,偶见胞核着色。对照组免疫阳性较弱呈浅黄色,随着饲粮中ZEA水平的升高,HSP70免疫阳性反应明显增强,颜色加深,呈黄色和棕黄色块状分布。断奶小母猪子宫中肌层、腺上皮、腔上皮及所测部分总HSP70免疫阳性物质的累积光密度（integrated optical density,IOD）随着饲粮中ZEA水平的升高均呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.05）线性升高;总体上,1.5 mg·kg^-1 处理的子宫HSP70免疫阳性物质的IOD显著高于0.5 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,0.5和1.0 mg·kg^-1处理又显著高于对照组（P＜0.05）。mRNA相对表达量结果显示,随着饲粮中ZEA水平的升高,断奶小母猪子宫内HSP70的mRNA相对表达量呈一次、二次线性升高（P＜0.001）,尽管1.0 mg·kg^-1和1.5 mg·kg^-1处理差异不显著（P＞0.05）,但1.5 mg·kg^-1 处理显著高于0.5 mg·kg^-1处理（P＜0.05）,0.5 mg·kg^-1处理又显著高于对照组（P＜0.05）。【结论】饲粮中0.5 mg·kg^-1 ZEA足以使子宫肌层和内膜明显增厚,子宫腺数量明显增多,使得子宫形态发生改变;本试验条件下,随ZEA浓度升高,HSP70免疫阳性反应增强,诱导子宫内HSP70的高水平表达,抵抗毒素应激对子宫细胞的损伤。     

LEF1基因在巴什拜羊不同毛色皮肤组织中的DNA甲基化及mRNA表达水平分析

【目的】分析LEF1基因在红棕色与青灰色巴什拜羊皮肤组织中DNA甲基化与mRNA的表达水平。【方法】运用BSP(亚硫酸盐修饰后测序PCR)与RT-RCR(实时荧光定量PCR),检测不同毛色巴什拜羊皮肤组织LEF1基因启动子区的甲基化水平与mRNA表达量。【结果】在红棕色巴什拜羊皮肤组织中的LEF1基因启动子区的甲基化水平高于青灰色的甲基化水平,且二者甲基化CpG位点不同,二者呈显著的负相关(P< 0.05)。【结论】DNA甲基化水平对红棕色与青灰色巴什拜羊的毛色形成具有调节作用,可作为一个候选的巴什拜羊毛色遗传标记。     

黔北麻羊毛色差异皮肤组织的蛋白组学研究

【目的】开展黔北麻羊黑白毛色差异的蛋白组学分析，明确影响其毛色差异的特异性蛋白及其通路，为揭示黔北麻羊特征毛色的形成机制提供参考依据。【方法】分别采集3只黔北麻羊公羊背部黑色羊毛皮肤组织块和腹部白色羊毛皮肤组织块，通过SDT裂解法提取黔北麻羊皮肤组织蛋白并进行蛋白定量分析，然后对筛选出的显著差异表达蛋白分别进行GO功能注释分析、KEGG通路富集分析及亚细胞定位分析。【结果】通过组间比较共筛选出420个显著差异表达蛋白，与白色羊毛对照组（White）相比，黑色羊毛试验组（Black）有247个显著差异表达蛋白呈上调表达、173个显著差异表达蛋白呈下调表达，其中与形成黑色羊毛的黑色素相关蛋白共有15个，包括表皮视黄醇脱氢酶2（SDR16C5）、视黄醇脱氢酶16（RDH16）、视黄醇饱和酶（RETSAT）和角蛋白79（KRT79）等9个上调蛋白，以及蛋白激酶B （AKT）、β抑制蛋白1 （ARRB1）和分泌型卷曲相关蛋白1 （SFRP1）等6个下调蛋白。GO功能注释分析结果表明，显著差异表达蛋白注释到生物学过程、分子功能和细胞组分三大功能的51条GO功能条目上；亚细胞定位分析显示有159个蛋白定位于细胞质、128个蛋白定位于细胞核及88个蛋白定位于线粒体； KEGG通路富集分析结果表明，这些显著差异表达蛋白富集在209条KEGG通路上，其中5条通路与黑色素生成相关，分别是视黄醇代谢（Retinol metabolism）、黑色素生成（Melanogenesis）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶—蛋白激酶B（PI3K-Akt）和Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路。【结论】导致黔北麻羊存在黑白毛色差异的原因:一方面是参与黑色素生成通路的KRT79及参与视黄醇通路的SDR16C5、RDH16和RETSAT等蛋白表达上调，促进黑色素细胞中黑色素的生成和黑色羊毛的形成；另一方面是参与PI3K-AKT通路的AKT表达下调，以及SFRP1表达下调而降低对Wnt/β-catenin信号通路的抑制，均有利于黑色素生成。