牛脂联素cDNA全基因序列的克隆

[目的]体外克隆牛脂联素基因的编码全序列。[方法]以成牛尾部脂肪的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得牛脂联素基因cDNA的全序列,将其克隆到原核表达载体PMD18-T中,筛选出阳性克隆,提取重组质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。[结果]从牛尾部脂肪组织总RNA中扩增得到671bp的目的条带,该cDNA序列与GenBank中牛脂联素基因序列同源性为100％,其氨基酸同源性也达到100％,确定为目的基因。[结论]该研究为进一步研究牛脂联素基因的功能和研究牛脂联素基因的表达与育肥牛的脂肪代谢的关系提供了试验基础。     

牛睫毛毛囊生长期毛乳头细胞cDNA表达文库的构建

为构建高质量的牛睫毛毛囊生长期毛乳头细胞cDNA表达文库,以新生荷斯坦牛上眼睑为组织材料,显微解剖分离出高纯度的生长期牛睫毛乳头,Trizol一步法提取总RNA后纯化mRNA;用ZAP Ex-press cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,进行末端修饰后接入ZAP表达载体。经GigapackⅢGold Pack-aging extract体外包装,转染XL1-Blue MRF′宿主菌,形成初级文库后进一步扩增,形成稳定的cDNA文库,文库库容量为3.3×107pfu/mL,重组率达95%。为进一步筛选、克隆生长期睫毛毛乳头特异性表达的基因、阐明睫毛毛囊发育的基因调控之分子机制奠定了研究基础。     

牦牛角真皮乳头cDNA文库的构建

构建cDNA表达文库用于克隆和研究牦牛角生长相关基因.Trizol提取牦牛角真皮乳头总RNA并纯化mRNA,用ZAP Express cDNA Synthesis Kit合成双链DNA,进行末端修饰,接入ZAP表达载体.经Gigapack Ⅲ Gold Packaging extract体外包装,转染XL1-Blue MRF'宿主菌,形成初级文库,初级文库进一步扩增形成稳定的cDNA文库.结果表明,文库库容量为4×107,重组率达93%,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效工具.     

拟南芥AtNHX1基因克隆和cre(lox)植物表达载体构建

从拟南芥叶片提取总RNA,经反转录得到cDNA。根据Genbank数据库中已登记的拟南芥Na /H 逆向转运蛋白基因AtNHX1的核苷酸序列设计并合成了1对克隆引物,通过PCR方法从cDNA中扩增出AtNHX1基因片段,将该目的片段克隆至pGEM-TEazy载体。通过酶切,从pGEM-TEazy载体上切下目的基因片段,替换pX6-GFP载体中的GFP基因,构建了AtNHX1基因cre/lox植物表达载体。     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。     

银杏GAPDH基因序列的初步克隆

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是生物体内糖酵解作用中的一个关键酶,由于其在细胞中表达量相对恒定而在植物研究中常被作为内源参照基因。在提取高质量银杏叶片总RNA的基础上,运用RT-PCR法对银杏GAPDH基因的部分序列进行了克隆。研究结果表明,使用SP提取法提取的银杏叶片组织总RNA质量高,28S RNA和18S RNA条带明亮清晰;用Oligo(dT)18为反转录引物,合成第一链,再利用GAPDH基因特异扩增引物进行PCR扩增,获得了银杏GAPDH基因的特异性cDNA片段,其长度大约为500bp。GAPDH基因的成功克隆为半定量RT-PCR以及Real-time RT-PCR等技术在银杏分子生物学研究中的应用提供了内标参照物。     

鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析

以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

牛RXRG基因cDNA的克隆及生物信息学分析

【目的】扩增了牛RXRG基因的序列,并对其进行了生物信息学分析。【方法】提取牛肌肉组织总RNA,利用RT-PCR技术,对牛RXRG基因进行了克隆,将得到的2条片段分别重组到PMD19-T载体并进行了序列测定;利用DNAMAN软件拼接得到2条片段序列,并运用DNAMAN软件及在线工具对拼接所得到的序列进行了生物信息学分析。以牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、脾脏、瘤胃、子宫、小肠、心脏、卵巢和肌肉等11个组织为材料,对牛RXRG基因在组织中的表达进行了分析。【结果】获得了长度为1 811 bp的牛RXRG基因cDNA,其由10个外显子组成,编码463个氨基酸;该基因与人、猪、猕猴、小鼠、大鼠在氨基酸序列上分别有89.5%,93.4%,87.2%,83.9%和85.2%的同源性。【结论】获得了牛RXRG基因长度为1 811 bp的cDNA序列,牛RXRG基因除在肌肉组织中高度表达外,在其他组织中均不表达。     

硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)对奶牛安全性的研究

【目的】了解硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)对健康奶牛的正常体温、日产奶量、奶中体细胞数和乳房内菌群的影响。【方法】选用初产和经产健康泌乳期奶牛各6头,所选奶牛在试验前30日内未全身性或乳房内给予任何抗生素,奶牛正常饲养管理,日粮和饮水中不含有任何抗菌药物。给药前1和0日统计记录各试验奶牛的直肠温度、日产奶量(早、中、晚3次产奶量的加和)、检测每个乳区采集奶样的体细胞数,并对给药前0日的奶样进行病原菌分离鉴定。4个乳区分别单次给予硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)。给药后的第1、3、5、7、10天分别统计记录每头奶牛的日产奶量,给药后的第12 h、3、5、7、10天分别采集奶样进行体细胞检测,同时检查直肠温度;给药后的第10天,采集奶样进行病原菌分离鉴定。比较奶牛用药前后直肠温度、日产奶量、牛奶体细胞数和奶中病原菌的变化。整个试验期间连续观察给药奶牛是否出现红、肿、热、痛等临床症状。【结果】给药前1天、0天和最后一次给药后的第1、3、5、7、10天,试验奶牛的日产奶量平均值分别为28.8、27.7、28.1、28.7、28.8、29.2和29.6 kg,卡方检验显示无显著性差异(P0.05);各时间点采集的奶中体细胞数大都维持在30—50万个/m L之间;各时间点测得的奶牛直肠温度平均值分别为38.3、38.4、38.3、38.3、38.3、38.2和38.3℃,无显著性差异(P0.05);病原菌检测结果显示,在给药前0日采集的奶样中,分离到大肠杆菌8株、链球菌5株和葡萄球菌7株,给药后第10天采集的奶样中大肠杆菌、链球菌和葡萄球菌各分离到1株,明显减少,且没有增加新的病原菌。【结论】硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)对奶牛正常体温、产奶量和奶中体细胞数等没有不良影响,该制剂用于奶牛是安全的。     

一种基于叉指式电极的牛奶体细胞数快速检测方法

牛奶体细胞数是评价牛奶质量好坏的一项重要指标。电检测方法是一种较容易实现自动化的快速检测技术。本文在已有牛奶体细胞数检测方法的研究基础上,结合传感器技术,提出了一种基于叉指式电极的快速检测方法,建立了牛奶样品的等效电路,验证了该方案的可行性。结果表明,测试奶样的电阻部分RS与奶牛的患病等级呈线性相关。该测试方法方便、快捷,可为牛奶体细胞数快速检测仪器的研制奠定一定的基础。     

奶牛乳体细胞数变化及影响因素调查

调查分析了大庆地区四个规模化牧场近3年奶牛DHI数据。结果表明,乳体细胞评分均值为5.05(其乳体细胞数均值为49万·mL-1)。75.75%的奶牛个体,其生鲜乳体细胞数小于50万·mL-1。胎次、泌乳阶段、自然月份等因素影响奶牛生鲜乳体细胞数。调查结果为牛场奶牛综合管理及制定科学可行的乳房炎防治措施提供依据。     

奶牛用头孢洛宁乳房注入剂（干乳期）的安全性评价

【目的】 确定自主研发新兽药——头孢洛宁乳房注入剂（干乳期）对靶动物的安全性。【方法】 选择经产和初产健康泌乳期奶牛各6头,入选前30日内未接受过全身性或乳房内抗生素给药,产奶量在15-35 kg。给药前1日、给药当日（0日）,记录各试验奶牛的日产奶量、直肠温度,并采集奶样进行体细胞检测。采样时先用清水冲洗乳房,用75%乙醇对乳头及周围进行消毒,待酒精挥发后,手工挤奶,弃去前三把奶后,采集奶样于灭菌试管中,贴好标签,低温（4℃）保存并于6 h内送实验室检测。给药当天,待奶牛挤完奶后,先用消毒毛巾清洁各乳区,再用消毒药液浸泡乳头约30 s,然后进行乳头内灌注给药。灌注时轻轻推压活塞,将药物缓缓注入乳池内,使药物均匀分布。按照推荐剂量,每头奶牛的4个乳区分别单次注入头孢洛宁乳房注入剂（干乳期）一支（含头孢洛宁250 mg）。给药后1日、3日、5日、7日和10日对4个乳区各采集奶样。记录奶牛标识、观察时间、试验日期和时间、每头奶牛日产奶量及体温等参数。检测乳样中体细胞数（SCC）,对给药当日（0日）和给药后第10日各采集的乳样进行细菌学检查。将各奶样接种至选择性培养基分离各种病原菌。分离菌株经纯化培养后,依据菌落形态、染色特征、生化特点鉴定其种类。主要分离金黄色葡萄球菌、链球菌（无乳链球菌、乳房链球菌）、大肠杆菌。【结果】 在整个试验期间,给药乳区未出现乳房红、肿、热、痛等临床症状。给药前1日、0日和给药后的1、3、5、7和10日,体细胞数大多在25-40万个/mL,平均体细胞数分别为33.26、32.74、32.70、31.63、31.24、30.62、30.04 万个/mL,给药后各时间点奶样体细胞数与给药前体细胞检测结果相比,体细胞数有所降低,但经重复测量方差分析显示无显著性差异（P>0.05）;日产奶量在23-33 kg,平均日产奶量分别为27.30、27.35、27.25、27.40、27.64、27.83、28.00 kg,经重复测量方差分析显示无显著性差异（P>0.05）;所有试验奶牛在给药前和给药后不同时间点的直肠温度均在奶牛的正常温度范围内（38.4-39.2℃）,直肠平均温度分别为38.79、38.82、38.83、38.77、38.71、38.71、38.69℃,经重复测量方差分析显示无显著性差异（P>0.05）;故按推荐剂量单次给药对奶牛的体细胞数、日产奶量、体温无显著影响。病原菌鉴定结果表明：在给药当日（0日）采集的乳样中,分离到链球菌、葡萄球菌和大肠杆菌分别为2、3和4株;给药后第10日,仅检测到葡萄球菌和链球菌各1株,给药前后目标菌数量有显著降低。【结论】 头孢洛宁乳房注入剂（干乳期）对奶牛体温、产奶量和奶中体细胞数等无不良影响,该制剂用于奶牛安全。     

Relationship of Somatic Cell Count with Milk Yield and Composition in Chinese Holstein Population

The objective of this study was to analyze the relationship of somatic cell count （SCC） with milk yield, fat and protein percentage, fat and protein yield using analysis of variance and correlation analysis in Chinese Holstein population. The 10 524 test-day records of 568 Chinese Holstein Cattle were obtained from 2 commercial herds in Xi＇an region of China during February 2002 to March 2009. Milk yield, fat percentage, fat and protein yield initially increased and then dropped down with parity, whereas protein percentage decreased and SCC increased. Analysis of variance showed highly significant effects of different subclasses SCC on milk yield and composition （P〈 0.01）. Compared with milk yield with SCC ≤ 200 000 cells mL-1, milk yield losses with SCC of 200 000-500 000 cells mL-1, 501000-1 000 000 cells mL-1, ≥ 1 000 000 cells mL-1 were 0.387, 0.961 and 2.351 kg, respectively. The highly significant negative correlation coefficient between somatic cell score （SCS） and milk and protein yield, milk yield and fat and protein percentage, protein percentage and fat yield were -0.084, -0.037, -0.061, -0.168, and -0.088, respectively （P〈 0.01）. The highly significant positive correlation coefficients between SCS and fat yield and fat and protein percentage, milk yield and fat and protein yield, fat percentage and protein percentage and fat yield, protein yield and protein percentage and fat yield were 0.041, 0.177, 0.105, 0.771, 0.865, 0.122, 0.568, 0.318, and 0.695, respectively （P〈 0.01）. There was no significant relationship between fat percentage and protein yield （P 〉 0.05）. The results of the present study first time provide the relevant base-line data for assessing milk production at Xi＇an region of China.     

不同体细胞数牛乳中乳蛋白的比较蛋白质组学研究

 【目的】分析不同体细胞数牛乳中乳蛋白的表达变化。【方法】采用二维凝胶电泳技术分离了低体细胞数、中体细胞数、高体细胞数和临床乳房炎的牛乳蛋白,考马斯亮蓝G-250溶液染色,液相色谱串联质谱检测表达变化的蛋白点。【结果】在中体细胞数和高体细胞数乳中酪蛋白水解产物和白蛋白增加,在临床乳房炎牛乳中 α-、β-和κ-酪蛋白几乎全部水解,而白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原β链和结合珠蛋白等乳清蛋白表达量增加。【结论】展示了不同体细胞数牛乳中乳蛋白的凝胶表达图谱,同时表明牛乳酪蛋白的水解程度随着体细胞数的增加而增加,至严重临床乳房炎时牛乳中酪蛋白几乎全部水解而乳清蛋白急剧增加。     

基于体细胞数的奶牛乳腺炎检测方法研究进展

奶牛乳腺炎的检测方法有很多,其中检测精度较高、实际应用较多的是直接或间接检测牛奶中体细胞含量的方法。介绍了检测奶牛乳腺炎的常用方法,并对基于体细胞数的检测方法和技术进行了综述,指出了这些方法存在的问题和不足,最后展望了基于体细胞数的检测方法和技术的发展趋势及应用前景。     

基于图像处理的牛奶体细胞计数方法的研究

在牛奶中,体细胞的数目对牛奶的质量及奶牛的乳房健康状况有很大的影响。由牛奶体细胞的彩色图像的特性,提出基于Y IQ/YUV彩色模型中的H分量灰度图像,利用种子点填充法获得二值图像,然后利用形态学运算优化二值图像,最终得到图像中的体细胞数。     

降低牛奶体细胞数的综合技术措施

概述了牛奶中体细胞的来源及其危害,总结了生产低体细胞优质牛奶的综合技术措施,并对实施效果进行了介绍。     

两种微生态制剂对澳洲荷斯坦奶牛生产性能的影响

[目的]研究微生态制剂对奶牛生产性能的影响.[方法]在新疆中州牛场选择450头年龄、胎次相同,泌乳量接近的澳洲荷斯坦奶牛,随机分成三组.第-组为对照组(CT组),第二组(XP组)每天饲喂50 g"益康XP",第三组(PM组)每天饲喂24g"PM发酵粉";试验期3个月,每10d测日产奶量,每月数据汇总处理,每月底采集乳样,检测其乳脂率、乳蛋白、乳糖、乳中4脂固形物、乳密度、冰点、体细胞数、pH值、灰分和电导率.[结果]与CT组相比,XP组与PM组均显著提高奶牛产奶量和乳脂率(P<0.05);与CT组相比,XP组和PM组均能有效降低乳中体细胞数(P>0.05),且以PM组效果更佳.此外,与CT组相比,XP组和PM组对乳糖、乳中非脂固形物、乳密度、冰点、灰分、电导率和pH值影响并不显著(P>0.05),[结论]在大规模奶牛试验中,XP组和PM组均提高了奶牛产奶量和乳品质,且PM组添加剂减少奶牛乳中体细胞数效果更加明显.