玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1 992 bp,开放阅读框为2 352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。     

青稞法尼基转移酶β亚基编码基因HbERA1的克隆及表达分析

ERA1(Enhanced response to ABA)基因编码法尼基转移酶(Farnesyl transferase)β亚基,该酶在干旱胁迫下对ABA信号负向调控因子的修饰起着关键作用。本研究以青稞(Hordeum vulgare subsp.vulgare)抗旱品种喜马拉雅10号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了ERA1基因全长cDNA序列,命名为HbERA1(登录号:KJ699392)。生物信息学分析表明,该基因全长1 401bp,可编码466个氨基酸序列,蛋白分子量为51.14kD,等电点为5.00。Prosite Scan分析结果表明,HbERA1含有多个干旱胁迫响应蛋白的作用位点,如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点。利用实时定量PCR方法研究了HbERA1在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况,发现在水分过剩处理下(土壤绝对含水量15.5%),HbERA1在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高,并随着土壤绝对含水量的下降而下调表达;进行干旱胁迫后(15.5%)基因表达量也明显下调表达;复水后表达逐渐恢复,复水8h时超过正常表达水平,表明HbERA1基因可能参与调控水涝和干旱胁迫双重信号传导。     

玉米ZmFAR1基因的克隆与表达分析

FARs为脂酰辅酶A还原酶，在植物生长发育和抵御非生物胁迫过程中起着重要作用。为进一步研究FARs在玉米中行使的生物学功能，在玉米中克隆1个脂酰辅酶A还原酶1基因(ZmFAR1)，该基因全长1 883 bp，开放阅读框长1 491 bp，编码496个氨基酸，分子量为55.983 k Da。生物信息学分析表明，ZmFAR1蛋白的分子式为C₂₅₂₂H₄₀₁₀N₆₉₀O₇₀₁S₂₄，为稳定的碱性亲水蛋白，存在59个磷酸化位点，未发现信号肽，存在跨膜结构域，最大可能定位于细胞质。氨基酸残基组成中主要以α螺旋和无规则卷曲为主。系统进化树分析表明，ZmFAR1蛋白与南荻和高粱的FAR蛋白相似度最高。利用实时荧光定量PCR技术对ZmFAR1在模拟盐、干旱两种非生物胁迫条件下对根、茎、叶3种组织的表达模式进行研究，结果表明，ZmFAR1呈现组织特异性表达，在叶中的表达量最高。盐和干旱处理下，ZmFAR1的表达量出现明显变化，推测ZmFAR1可能在不同程度参与了玉米对非生物胁迫的应答。     

玉米生长调节因子(GRF)家族的全基因组鉴定及在非生物胁迫下的表达研究

以拟南芥作为种子序列进行Blastp序列比对,共鉴定15个ZmGRFs基因,对其理化性质、系统进化关系等在非生物胁迫下的表达进行分析。根据系统发育树分析表明,ZmGRFs基因与单子叶植物水稻亲缘关系较近,15个ZmGRFs基因分别定位在1、2、4、5、6、7、9、10号染色体上且各个基因之间高度同源,每个亚族之间基因结构及保守基序均相对保守。ZmGRFs蛋白二级结构均以α-螺旋和无规卷曲为主。根据磷酸化位点预测分析表明,除ZmGRF6和ZmGRF9不含酪氨酸外,其他ZmGRFs蛋白均含有潜在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点且各蛋白之间的潜在的磷酸化位点数目差异较大。根据转录组数据分析表明,ZmGRF4和ZmGRF13基因在NaHCO3上调表达,同时发现热、盐和干旱胁迫下ZmGRF4和ZmGRF13基因表达较高,冷胁迫下ZmGRF1/3/4/15基因表达较高。根据不同组织部位表达谱分析显示,ZmGRF4和ZmGRF13在各个部位表达均较高。     

玉米幼苗叶表面蜡质含量及成分对干旱胁迫的响应

选用抗旱性不同的两个玉米自交系Mo17和B73为试验材料,采用盆栽控水试验,设置干旱和正常浇水两个处理,研究干旱胁迫对两个玉米品种3叶期幼苗叶面蜡质含量及成分变化的影响。结果表明,在干旱处理条件下,Mo17和B73的叶片失水率和叶绿素的抽提率均低于正常条件;两个品种叶面的蜡质含量均明显高于正常条件下的蜡质含量,且Mo17在正常和干旱条件下蜡质含量均高于B73。此外,在干旱条件下,蜡质合成相关的基因KCS、CER1、CER2、GL1、GL2和GL15的表达也明显增高。玉米叶片表面蜡质合成是应答干旱胁迫的一种重要方式,抗旱品种Mo17的抗旱性比B73要强,其表面蜡质合成较强是其中一个重要原因。     

小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定

为了克隆小麦干旱应答基因,构建了干旱诱导的小麦cDNA文库,并从文库中分离了一个DREB类转录因子基因TaDREB6.序列分析表明,TaDREB6具有一个837bp的开放阅读框和242bp的3非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域.采用该基因特异引物PCR技术对一套中国春缺体-四体材料进行扩增,将TaDREB6定位于3A染色体上.这是首次将一个小麦DREB基因定位在特定的染色体上.RT-PCR分析表明,TaDREB6基因受干旱胁迫诱导表达;亚细胞定位结果表明,TaDREB6-hGFP融合蛋白定位于细胞核中.上述结果说明,小麦TaDREB6基因编码的蛋白可能在细胞核内对干旱胁迫应答反应起调控作用.     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

大豆GmGLP10基因的克隆及生物信息学分析

通过PCR的方法从大豆抗菌核病品种Maple Arrow中克隆得到Gm GLP10基因,生物信息学分析结果显示Gm GLP10蛋白由213个氨基酸组成,具有一个糖基化位点和多个磷酸化位点,为胞外分泌蛋白。通过对Gm GLP10基因起始密码子上游1 500 bp序列进行顺式作用元件分析,预测Gm GLP10启动子上具有多个与激素和防御胁迫应答相关的顺式作用元件。进化树分析结果表明,Gm GLP10与多个生长素结合蛋白进化距离较近,推断其可能具有相似的功能。Gm GLP10基因在菌核病菌胁迫下的转录本丰度的变化结果表明在菌核胁迫处理后Gm GLP10基因表达量上调明显。Gm GLP10可能作为生长素结合蛋白参与调控大豆的生长发育与抗病防御应答反应。     

小麦TaPK7基因的克隆及其在多种胁迫条件下的表达分析

为了揭示小麦TaPK7基因对不同逆境胁迫的应答机制, 以SAPK7基因的全长cDNA序列为信息探针,采用电子克隆和RT-PCR的方法,从抗旱小麦品种旱选10号中克隆到一个包含1 074 bp开放阅读框、编码357个氨基酸的cDNA序列,命名为TaPK7.生物信息学分析表明,TaPK7同时具有磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的活性.氨基酸序列比对发现,TaPK7与水稻、玉米、大麦等植物中受逆境胁迫诱导表达的直系同源基因高度同源.实时定量RT-PCR检测结果表明,TaPK7参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫和ABA处理的应答反应,但在不同胁迫或处理下的表达模式不同,TaPK7对四种非生物胁迫的敏感性次序为:高盐＞高渗＞低温＞ABA.     

玉米自交系不同生育期的抗旱性鉴定及生理响应机制研究

以17份黄淮海常用骨干系及自选系为材料,不同生育期进行干旱胁迫,筛选抗旱性强的玉米种植资源,并探讨其抗旱的生理机制。方差分析表明,与正常水分相比,胁迫后的抽雄至散粉间隔未达显著水平,但ASI间隔达显著水平;不同生育期自交系的叶绿素含量、Fv/Fm和Fv/Fo均下降,SOD和POD活性均提高,但不同自交系下降或上升的幅度不同,且不同自交系间、胁迫与对照间指标差异及两因素交互作用均达极显著水平。灰色关联度表明,POD活性无论是拔节期还是抽雄期都与ASI关联度很高,可作为筛选抗旱型材料的一个重要指标。模糊隶属函数法鉴定出超4F、郑36、CIMBL12、郑63、HCL645、郑6611和PH6WC在两个生育期均属于抗旱型自交系,其中,超4F、郑36和郑63拔节期和抽雄期干旱胁迫后,ASI增大幅度较小,叶绿素含量、叶绿素荧光参数Fv/Fm和Fv/Fo抗旱指数均较高,说明这3个自交系遭受干旱胁迫时主要通过调节光合系统这种机制来提高抗旱性。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

小麦SnRK2家族基因鉴定及进化分析

SnRK2是一种植物特异性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在植物生长发育和胁迫耐受信号传递过程中发挥着至关重要的作用。为探索SnRK2在小麦抗逆中的作用，基于最新的小麦基因组信息，采用blastp和hmmer两种方法在普通小麦中共鉴定到30个SnRK2基因家族成员。系统发育分析表明，SnRK2基因在普通小麦及其祖先物种的进化过程中高度保守。利用RNA seq数据分析小麦SnRK2基因在不同组织以及不同胁迫条件下的表达模式，结果表明，小麦SnRK2基因家族成员在不同组织以及不同胁迫条件下表达量均存在差异，且具有显著的组织特异性。通过qRT PCR进一步验证6个小麦SnRK2基因的表达模式，发现不同基因之间的表达量存在明显差异，推测小麦SnRK2基因家族的部分成员出现功能分化。随后，利用已发表的六倍体小麦重测序数据，分析不同小麦群体中SnRK2基因的核苷酸多样性(P_i)和分化指数(F_st)，并解析单倍型，推测Ta 5B SnRK2.28基因的AA单倍型为优异等位变异。通过同源建模预测小麦SnRK2蛋白的三维结构，发现小麦SnRK2蛋白结构在进化上高度保守。     

玉米蜕皮激素合成酶基因ZmCYP92A1的克隆和表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从玉米中克隆ZmCYP92A1,GenBank登录号为KY270496.1。该基因全长1 713 bp,开放阅读框为1 551 bp,编码517个氨基酸。预测ZmCYP92A1蛋白分子量为58.58 kD,理论等电点为6.44,存在2个跨膜结构域,1个信号肽,有1个P450保守结构域。多序列比对表明,ZmCYP92A1蛋白与其他物种的CYP92A1蛋白具有极高的相似性。系统发生分析揭示,CYP92A1蛋白与属于CYP75亚家族的类黄酮3-单加氧酶的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果发现,非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)均诱导ZmCYP92A1基因的表达,表明该基因参与植物抵御非生物胁迫。     

小麦细胞色素P450(TaP450)基因的克隆与序列分析

细胞色素P450是一种多功能氧化酶,在植物体内担当着生物合成、代谢解毒以及抗逆等重要功能。本研究采用RACE方法从普通小麦中同源克隆到一个新的P450基因,命名为TaP450(Genbank No.KJ541960)。该基因基因组序列全长为2 643bp,含有2个外显子和1个内含子,cDNA全长为2 033bp,含有一个1 557bp的开放读码框,推导蛋白含518个氨基酸;序列分析发现其具有保守的P450结构域,但该蛋白与已报道的小麦P450蛋白序列有较大差异,表明它是小麦P450家族的新成员;蛋白结构特征分析发现,该蛋白的分子量为57.092kD,等电点为8.63,N端具有一个含29个氨基酸的跨膜结构和一个含22个氨基酸的信号肽,亚细胞定位分析表明该蛋白属于分泌蛋白。其在小麦叶片、茎、根与种子中均有表达,但在叶片和茎中表达量最高;在胁迫处理下,该基因的表达量均上调,且在盐胁迫处理下上调尤为显著,表明该基因与盐胁迫密切相关。     

黑麦GIF基因家族全基因组鉴定及其表达分析

生长调节互作因子(GRF-interacting factor, GIF)是植物体内一类转录共激活因子,在植物生长发育过程中起重要作用。为挖掘和利用黑麦GIF家族基因,利用同源比对方法对黑麦GIF基因家族进行了鉴定,并系统分析了黑麦与其他禾本科植物及模式植物拟南芥GIF基因的系统发育关系、蛋白结构域、基因结构和共线性关系。结果显示,在黑麦基因组中共鉴定到3个GIF基因家族成员,分布在4R和5R染色体上;系统进化分析发现,黑麦GIF基因家族成员与小麦和大麦的亲缘关系更近。蛋白结构域和基因结构分析发现,GIF基因家族成员在黑麦及其他禾本科植物中的蛋白结构域和基因结构相对保守,均含有4个外显子。共线性分析发现,黑麦ScGIF1基因与其他禾本科植物GIF基因间均存在共线性关系,其中与小麦间共线基因数最多。Ka/Ks分析发现,黑麦GIF基因家族成员在进化中受到纯化选择。此外,在黑麦穗部鉴定到一个特异性高表达的GIF基因(ScGIF1),其编码的蛋白含有多个磷酸化位点,推测ScGIF1蛋白可能是通过磷酸化来调控黑麦麦穗的发育和粒型的。     

TaJAZ7D蛋白在冬小麦JA抗寒途径中的作用

转录抑制因子JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是茉莉酸（Jasmonate,JA）信号转导途径的核心元件,前人研究发现,拟南芥中AtJAZ1、AtJAZ4与AtICE1蛋白互作可抑制 AtICE1基因的转录,负调控拟南芥的抗寒性,然而小麦中TaJAZ与TaICE蛋白的互作调控机制尚不清楚。本研究以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,以与拟南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白高度同源的TaJAZ7、TaJAZ12蛋白为对象,检测外源茉莉酸甲酯（MeJA）对低温胁迫下 TaJAZ7、 TaJAZ12基因表达量的影响。结果发现, TaJAZ7基因的表达量与温度变化呈明显负相关,故对TaJAZ7(以TaJAZ7D为研究对象进行后续研究)蛋白进行生物信息学分析和亚细胞定位,并利用酵母双杂交技术验证TaJAZ7D蛋白与TaMYC2和TaICE41蛋白的互作。生物信息学分析表明, TaJAZ7D基因编码区序列全长为633 bp,为不稳定的亲水性混合型蛋白;TaJAZ7D蛋白有典型的TIFY和Jas结构域,属于TIFY家族。亚细胞定位发现,TaJAZ7D蛋白位于细胞核中。酵母双杂交验证试验发现,TaJAZ7D蛋白与TaMYC2和TaICE41蛋白分别存在互作关系。     

小麦PHO基因家族全基因组鉴定及表达分析

PHO基因家族主要参与磷酸盐的转运,在植物生长发育中起重要作用。为研究小麦PHO基因家族成员的潜在功能,本研究从小麦全基因组中鉴定PHO基因家族成员,并利用生物信息学手段对其基因结构特征、蛋白结构域、系统进化、顺式作用元件及表达特性进行分析。结果在小麦全基因组中共鉴定到12个PHO基因家族成员,所有成员均含有SPX和EXS结构域。系统进化、保守结构域和基因结构分析发现,小麦PHO蛋白与拟南芥PHO1-H1蛋白以及水稻PHO1蛋白亲缘关系较近;除TaPHO7、TaPHO10、TaPHO11和TaPHO12蛋白缺少部分基序外,其余小麦PHO蛋白均具有完整基序,且同一亚组内的成员具有相似的蛋白保守结构域和基因结构,说明PHO亚家族成员间高度保守。顺式作用元件分析发现,小麦PHO基因启动子区域含有与磷调控相关的激素诱导、光响应、低温响应等元件。基于RNA＿seq数据的组织特异性分析发现,大部分PHO基因在根中的表达量较高。qRT-PCR分析发现,低磷胁迫处理下磷高效小麦品种小偃54地下部分(根) TaPHO7和 TaPHO8基因的表达量显著高于对照。     

玉米BBR-BPC基因家族全基因组鉴定及表达分析

对玉米BBR-BPC基因家族进行全基因组鉴定,分析基因结构、染色体分布和启动子顺式作用元件结合位点、分布和数量情况以及编码蛋白的理化性质、保守基序和蛋白二级三级结构、进化关系,基于转录组的结果研究基因的组织表达模式和高温、干旱等非生物胁迫以及外源生长素等诱导表达模式。结果表明,玉米BBR-BPC家族共有4个成员,家族基因的结构存在较大的差异,且存在可变剪切,共编码9个蛋白。定位分析发现,BBR-BPC1.1和BBR-BPC4定位在细胞核,其余除定位在细胞核,叶绿体中也有分布。BBR-BPC启动子区存在多种逆境胁迫、植物激素、组织部位特异表达、光响应等顺式作用元件。BBR-BPC成员在玉米不同材料、不同组织部位中的表达水平差异较大且受热、干旱等胁迫调控。在B73和Mo17材料中,BBR-BPC受热胁迫诱导表达,与qRT-PCR验证结果一致。研究结果表明,ZmBBR-BPC基因家族不同成员会在特定部位激活或者抑制相关基因表达,响应非生物胁迫。