小麦TaCYP78A5基因的克隆及生物信息学分析

细胞色素P450(Cytochromes P450)蛋白家族含有硫羟基和血红素结构域,参与多种生物合成,CYP78A家族成员对籽粒大小形成有重要的功能。利用同源克隆的方法,分别从小麦大粒品系‘P271’和小粒材料‘中国春’中扩增到位于2AS、2BS、2DS上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D基因,编码534、544、549个氨基酸。通过分析发现在‘P271’和‘中国春’克隆到的TaCYP78A5序列一致,说明TaCYP78A5基因在这2个粒型的小麦中是保守的。CYP78A家族在水稻和拟南芥中具有非自主性细胞表达模式,结合对CYP78A家族的生物进化关系研究发现,CYP78A家族的各个基因在单子叶植物中是保守的。‘P271’和‘中国春’籽粒大小的差异,可能是TaCYP78A5基因在‘P271’中的基因表达量高于‘中国春’,引起种子发育过程中内表皮细胞的增殖,从而促进种子表皮增大,使得‘P271’种子大小和质量增加。     

小麦控制籽粒大小基因功能研究取得新进展

<正>近日,西北农林科技大学生命科学学院赵惠贤教授团队在小麦控制籽粒大小基因克隆及功能研究方面中取得新进展:克隆得到位于小麦第7条同源群染色体短臂上CYP78A家族的新基因Ta CYP78A3;利用BSMV-VIGS技术沉默Ta CYP78A3基因在小麦籽粒中的表达,导致小麦种子大小降低11%(P0.01);通过转基因拟南芥过表达Ta CYP78A3基因,导致拟南芥种子增大11%~47%(P0.01)。进一步的细胞学观察和分子水平检测,揭示了小麦     

细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析

依据家蚕基因组数据, 通过BLASTP比对, 选择了主要与抗性相关的CYP3集团(clan)中具有完全编码框并含有P450基因特征结构域的1条序列为研究对象, 用RT-PCR方法对其进行了克隆. 结果表明, 该基因ORF为1 467 bp, 编码489个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.60 KDa, 等电点为8.64. 只有1个内含子, 外显子/内含子边界处符合GT-AG规则. 与美国棉铃虫的CYP321A、邪恶按蚊的CYP6P9的相似性(identity)相对较高, 分别为34%、 32%, 低于同一家族成员氨基酸相似性应高于40%的规定, 从而被细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1(GenBank 登陆号: EF415297).     

星豹蛛CYP3313A3基因克隆与生物信息学分析

[目的]星豹蛛是农业害虫的重要捕食性天敌,本课题组通过转录组测序鉴定出66条星豹蛛细胞色素P450基因,筛选分析出5条基因预测其与外源物质代谢有关,选取其中一条基因进行克隆并进行生物信息学分析。[方法]本试验采用RT-PCR技术,将提取的星豹蛛总RNA进行反转录PCR扩增,用割胶回收的扩增产物完成克隆及测序,并对CYP3313A3基因编码产物进行生物信息学分析。[结果]克隆到CYP3313A3基因序列,该基因开放阅读框为906bp,编码301个氨基酸,其相对分子质量为34. 38 kDa,等电点6. 12,原子总数4 865,分子式C_(1546)H_(2451)N_(403)O_(449)S_(16);其中正电荷残基36个,占氨基酸总数的12%,负电荷残基39个,占氨基酸总数的13%,编码蛋白存在细胞色素P450 3A亚族特征基序,其编码的蛋白的二级结构中,α螺旋为45. 18%,β折叠为14. 29%,β转角为3. 32%,无规则卷曲为37. 21%,亚细胞定位结果显示在内质网上。对其编码的蛋白进行信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽;对该蛋白的跨膜结构预测分析,结果显示该蛋白不存在跨膜结构。[结论]获得的CYP3313A3基因属于CYP3家族,本研究对今后星豹蛛细胞色素P450基因的研究提供了研究基础。     

陆地棉蛋白质二硫键异构酶基因(GhPDIL5-2a)的克隆及其在花药中的表达分析

利用电子克隆的方法设计特异引物,克隆陆地棉的1个二硫键异构酶(Protein disulphide isomerase like)基因的全长序列。序列分析表明:该基因没有内含子,开放阅读框的长度为1 293bp,编码的多肽序列含有430个氨基酸。该基因与红麻HcPDIL5-2a基因具有97%的相似性,将该基因命名为棉花GhPDIL5-2a。取单核期花药进行半定量RT-PCR分析发现:GhPDIL5-2a在陆地棉洞A不育株和可育株花药中表达无差异,在供试的其他不同品种中的表达也无差异。     

海岛棉一个成花素类似基因的克隆和生物信息学分析

[目的]海岛棉成花素类似基因的克隆及生物信息学分析.[方法]利用RT - PCR技术,从海岛棉中克隆成花素FLOWERING LOCUST(FT)的同源基因,并进行生物信息学分析.[结果]从新海14号花后15 d纤维中,克隆到一个棉花成花素类似基因FLOWERING LOCUS T- LIKE1,命名为GbFTL1.该基因的开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸.蛋白比对表明bFTL1和AtFT的相似性为79.3;,和陆地棉GhFTL1的相似性为99.4;,GbFTL1第37位氨基酸为Asn(N),而GhFTL1第37位氨基酸为Ser(S).GbFTL1含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及14个保守氨基酸,系统进化树分析表明GbFTL1属于FT亚家族成员.[结论]GbFTL1基因可能为海岛棉中促进开花的基因之一.     

家蚕细胞色素P450基因CYP18A1的克隆与RNA干涉载体的获得

根据GenBank已登录细胞色素P450 CYP18A1基因的序列设计引物,用RT-PCR方法克隆了AK1蚕的CYP18A1基因,并对基因序列进行了分析,研究了基因的表达.并将该基因亚克隆至L4440载体,为基因功能的研究奠定了基础.     

细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析

依据家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择了主要与抗性相关的CYP3集团（clan）中具有完全编码框并含有P450基因特征结构域的1条序列为研究对象,用RT-PCR方法对其进行了克隆.结果表明,该基因ORF为1 467 bp,编码489个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.60 KDa,等电点为8.64.只有1个内含子,外显子/内含子边界处符合GT-AG规则.与美国棉铃虫的CYP321A、邪恶按蚊的CYP6P9的相似性（identity）相对较高,分别为34%、32%,低于同一家族成员氨基酸相似性应高于40%的规定,从而被细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1（GenBank登陆号：EF415297）.     

版纳微型猪近交系细胞色素P450家族基因CYP1A1克隆及生物信息学分析

【目的】克隆版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)细胞色素P450家族基因CYP1A1的编码区序列,并对其进行生物信息学分析。【方法】利用RT-PCR方法获得CYP1A1基因的全长CDS序列,运用生物信息学对其核酸及蛋白序列进行分析,构建系统进化树。【结果】获得的BMI CYP1A1 CDS长度为1551 bp,编码516个氨基酸,蛋白质分子量为58.39 ku,等电点为7.83,位于内质网的概率是94.1%。CYP1A1蛋白质含有1个细胞色素P450半胱氨酸血红素配体位点,1个N-豆蔻酰化位点,1个酰胺化作用位点,2个N-糖基化位点、6个蛋白酶C磷酸化位点和5个蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。11个物种构建的系统进化分析表明,BMI(猪)CYP1A1与牛和山羊的关系最近。【结论】以上结果将为进一步研究版纳微型猪近交系CYP1A1基因功能奠定基础。     

陆地棉CNGC全基因组鉴定及表达分析

环状核苷酸门控通道(CNGC)基因家族是非选择性阳离子通道基因家族之一,在与植物发育和环境胁迫等有关的生理生化过程中起着至关重要的作用,但是目前尚无陆地棉CNGC基因家族的全基因组鉴定和分析.基于已知的拟南芥CNGC基因家族成员序列信息,以生物信息学方法分析陆地棉基因组中CNGC家族成员的理化性质、系统发育、染色体定位和差异表达情况.结果表明,共鉴定出33个GhCNGC基因,它们不均匀地分布在A、D染色体亚组上,其中15个基因分布在A染色体亚组上,18个基因分布在D染色体亚组上.系统发育分析结果表明,GhCNGC基因家族被分为4个主要组,由于在进化过程中不均等地扩增,Ⅳ组又分为Ⅳa和Ⅳb组.同组陆地棉、拟南芥的CNGC基因显示出相似的保守基序和基因结构,尤其是同源性越近,相似度越高.GhCNGC基因的表达谱以组织特异性模式表达,多数基因在根、叶中的表达量较高.研究结果使人们增加了对陆地棉和其他植物中CNGC基因家族的了解.     

不同种群密度条件下龙葵对棉花生长及生理生化指标的影响

【目的】 研究不同密度龙葵对棉花生长和生理生化指标的影响。【方法】 将龙葵设为0、10~30、30~50、50~70、70~90和 90~110株/m² 6个密度处理,分别在棉花苗期、蕾期和花铃期测定棉花株高、主根长及叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白含量、MDA含量、CAT活性、SOD活性和POD活性。【结果】 在棉花蕾期和花铃期棉花株高、根长和叶绿素含量均随龙葵种群密度的增加而减少。在棉花蕾期时龙葵对棉花叶片MDA含量、CAT活性、SOD活性和POD活性影响最大。其中龙葵种群密度为50~70株/m²时对棉花MDA含量以及CAT、SOD和POD活性影响最大,分别为0.05 mg/g、5.53 U/g、10.96 U/g和7 893.24 U/g。龙葵种群密度为0、10~30和30~50株/m²时对棉花株数和单株结铃数影响不显著,且龙葵种群密度为0和10~30株/m²时,对棉花铃重影响不显著。【结论】 龙葵种群密度控制在30株/m ² 以下。     

早熟陆地棉主要株型性状与产量的相关性

【目的】分析早熟陆地棉主要株型性状与产量的相关性,为新疆早熟陆地棉品种选育提供科学依据。【方法】采用SPSS 19.0软件,对早熟陆地棉品种的籽棉产量与株型性状进行相关性分析、通径分析和逐步回归分析。通过对产量与株型性状的逐步回归分析,得出产量与株型性状之间的最优回归模型。【结果】对早熟陆地棉籽棉产量有直接作用且有极显著影响的因子(P＜0.01),依次是:株高(X₁)、铃数(X₄)、始节位(X₂),对产量(Y)的直接相关系数分别为:0.322 1、0.298 1、-0.216 2;果枝数(X₃)对Y值直接作用较小,系数为0.082 04,通过其他因子对Y值的间接作用较大,简单相关系数为0.403,相关性极显著(P＜0.01)。早熟陆地棉株型性状(X_i)对产量(Y)的最优回归方程:Y=173.898+2.279 X₁-17.632 X₂+21.795 X₄。估测值与实测值之间的相关程度为0.527,决定系数R²为0.278。【结论】株高、铃数、果枝始节位对产量性状有直接作用,且作用显著;而果枝台数对产量有间接作用,且作用显著。     

海岛棉GbPR10基因的克隆及其抗枯萎病表达分析

【目的】为棉花抗枯萎病分子育种的基因来源提供依据。【方法】根据前期转录组测序和抗病表达数据,从棉花EST数据库中筛选出抗枯萎病有关的基因(登录号为CD486053)序列,在NCBI搜索与该基因同源性为94%的海岛棉抗病相关PR10基因(登录号为AY588276)并设计引物,从枯萎病接菌的抗病海岛棉材料“06-146”克隆一个海岛棉同源基因,命名为GbPR10基因。进行生物信息学和在枯萎病菌、乙烯、水杨酸处理下基因表达量分析。【结果】GbPR10基因有480 bp的ORF序列,编码159个氨基酸。该蛋白序列中具有PR10蛋白特有的Bet-v1结构域和改变的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG)。蛋白质序列同源比对表明该蛋白与其他生物PR10蛋白有较高的一致性。亚细胞定位预测表明GbPR10分布于细胞质。qRT-PCR表达分析表明,GbPR10基因在不同抗病海岛棉品种的不同组织上表达量不均匀而较高于感病海岛棉品种;在乙烯和水杨酸处理的1对抗/感海岛棉根系中,抗病品种出现先上调后下调趋势,感病材料后期诱导表达,抗病品种的表达量几乎高于感病品种。【结论】GbPR10基因在海岛棉抗枯萎病信号途径中起重要作用。     

棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。     

陆地棉半矮秆免打顶突变体sd农艺和产量性状的研究

【目的】 研究免打顶对陆地棉半矮秆突变体sd农艺及产量性状的影响,对培育棉花免打顶新品种实现植棉全程机械化。【方法】以新陆早17号及其半矮秆突变体sd为材料,在未打顶化控处理下,比较分析未打顶对半矮秆突变体sd主要农艺和产量性状的影响。【结果】在未打顶化控处理下,突变体sd与其在打顶化控、打顶未化控和未打顶未化控处理下的株高差异显著,而始果枝高、始果枝始节位、主茎节间平均长度等农艺性状差异不显著。【结论】在未打顶化控条件下,突变体sd株型表现稳定,成熟期时平均株高65 cm,后期茎尖生长趋于停止,表现为免打顶效果,而且突变体sd的吐絮集中,敞开度适中,霜前花率高,株型紧凑,始果枝高18 cm以上,主茎节间长度在5~6 cm,平均结铃5.5个,多分布在中部果枝。突变体sd的这些株型特征符合机采棉形态要求,可作为棉花株型育种重要的种质,为培育株高稳定株型适宜的免打顶机采棉品种提供了有效的资源储备。     

陆地棉扩展蛋白基因的鉴定与特征分析

目的 扩展蛋白（Expansin）是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。方法 利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。结果 陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种（亚洲棉与雷蒙德氏棉）的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因（2—4个）,具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个（亚）基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai. 005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织（如子叶、新叶、老叶、苞叶）中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。结论 陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。     

棉花1膜3行模式下密度和缩节胺用量优化组合

【目的】研究棉花1膜3行种植模式下,密度与缩节胺用量对棉花生长发育及产量的影响及互作效应,分析此模式下棉花植密度和缩节胺优化组合,为该技术在生产上推广应用提供依据。【方法】棉花1模3行模式下,采用裂区设计,密度为主处理,设置3个水平,分别为9.4×10⁴ 、14.1×10⁴和18.8×10⁴株/hm²;缩节胺用量为副处理,也设置3个水平,90、180和270 g/hm²,研究两因素作用下,棉花生长发育及产量的变化。【结果】株高与密度呈正相关,而与缩节胺的用量呈负相关;棉株茎粗与密度呈负相关,与缩节胺的用量呈正相关;籽棉产量随密度与缩节胺用量的增加呈先增后减趋势。【结论】棉花种植密度在14.1×10⁴株/hm²,缩节胺180 g/hm²时,最有利于棉花的生长发育及产量的形成。     

棉花CRVW的克隆与抗黄萎病功能分析

目的 黄萎病（Verticillium wilt）是棉花生产上的重要病害,严重影响棉花的产量和品质。棉花基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。通过对一个尚未有功能注释的陆地棉基因CRVW（cotton resistance to Verticillium wilt）进行克隆与抗病功能验证,为棉花基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面奠定基础。方法 根据参考基因组序列设计引物,同源克隆陆地棉（Gossypium hirsutum）农大601（ND601）中CRVW的开放读码框（open reading frame,ORF）。利用在线工具ProtParam预测蛋白氨基酸组成、分子量、理论等电点、不稳定指数和总平均亲水性等性质;应用PSIPRED v3.3预测蛋白二级结构;在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测;PlantCARE在线软件分析顺式作用元件。构建CRVW与绿色荧光蛋白基因融合表达载体,通过基因枪介导法转化洋葱表皮细胞,观察CRVW的表达位置。利用qRT-PCR检测CRVW在棉花不同组织、黄萎病菌胁迫条件下不同抗、感品种间,以及水杨酸（salicylic acid,SA）诱导处理条件下的表达模式。构建CRVW沉默载体,应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在棉花中的抗病功能。检测CRVW沉默后一些与植物抗病调控相关标志基因的表达变化,分析其介导的抗病通路。结果 从陆地棉品种ND601中克隆到CRVW的ORF,其全长780 bp,编码259个氨基酸残基,分子量约为30.2 kD,理论等电点9.59;蛋白二级结构含69.50%不规则卷曲、17.76% α-螺旋、11.20%延伸链和1.54% β-卷曲。综合生物信息学预测和荧光观察结果,显示CRVW主要存在于植物细胞膜和细胞质。CRVW在棉花根、茎和叶中都有表达,但在根中的表达量最高。CRVW的ORF上游序列（CRVW-P）中包括响应乙烯（ethylene）、SA、生长素（auxin）和脱落酸（abscisic acid）等4种激素信号的顺式作用元件。另外,CRVW-P还包括一些与伤害、防御、胁迫、病菌、干旱和低温等相关的顺式作用元件。SA喷洒处理后,CRVW显著上调表达。黄萎病菌胁迫后,CRVW在抗病品种ND601和感病品种中棉所8号（CCRI8）中均显著上调表达,但在感病品种中上调表达的发生时间明显滞后。黄萎病菌处理20 d后,CRVW沉默组棉苗表现出比对照（CK）组更明显的黄化、萎蔫和落叶等黄萎病病症。进一步统计分析显示,CRVW沉默组病指显著高于CK组,表明CRVW沉默显著降低了棉苗对黄萎病菌的抗性。沉默CRVW后,棉苗中SA含量显著降低;ICS1（isochorismate synthase 1）、EDS1（enhanced disease susceptibility 1）、PAD4（phytoalexin deficient 4）、NPR1（nonexpresser of PR gene 1）和PR1（pathogenesis-related protein 1）等与SA积累和信号调控相关的标志基因均发生显著下调表达。结论 CRVW定位于细胞质和细胞膜,主要在棉花根部表达,可能通过SA信号通道参与棉花抗黄萎病反应过程。     

扁杆藨草持续危害对棉花农艺和经济性状的影响

【目的】研究扁杆藨草持续危害对棉花的影响,为棉田该杂草科学防治提供依据。【方法】扁杆藨草种群密度设为60 株/m² ,测定其持续危害0、10、20、30、40、50 、60 d和全生育期棉花株高、茎粗、主茎节数、结铃数、单铃重、产量和纤维品质指标。【结果】棉花株高和茎粗随扁杆藨草危害持续期延长而减小。扁杆藨草持续危害期小于30 d,对棉花主茎节数和果枝数影响不显著,大于30 d则显著减少。扁杆藨草持续危害期对棉花中部和下部果枝结铃数影响不显著,显著引起上部果枝结铃数、单铃重减少。扁杆藨草持续危害期大于10 d,可使棉花产量显著减少,导致棉纤维品质指标下降。【结论】依据棉花产量指标,扁杆藨草防除应不晚于棉花打顶前30 d。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

[目的]研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用.[方法]以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列.利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列.[结果]采...