致猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛单克隆抗体的研制及其初步应用

将致猪水肿病大肠杆菌 F18ab菌毛提纯 ,以其免疫 BAL B/ c小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,经 3次融合 ,共筛选出 4株能稳定分泌针对 F18ab菌毛的特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株 4 G8、4 H11、4 A2和 3A12 ,腹水单抗的直接凝集价最高可达 1∶ 32 0 0。免疫印迹试验表明 ,4株腹水单抗均可特异识别 F18ab菌毛 Mr 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 11株猪水肿病大肠杆菌分离株 F18ab菌毛表达情况进行了检测 ,结果显示 ,上述分离株中F18ab菌毛的出现率为 72 .7% (8/ 11) ,检出的 F18ab菌毛阳性分离株的 O血清型均为 O1 39。     

大肠杆菌F18菌毛的研究进展

F18菌毛是致猪水肿病的产Vero细胞毒素大肠杆菌(VTEC)及某些产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一.现已知,F18菌毛抗原有F18ab、F18ac两种血清型变异,F18ab即为F107,而F18ac则包括近来才发现并命名的菌毛2134P及定居因子8813.现将有关F18菌毛的研究进展概述如下.     

猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位与志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位的联合表达

扩增、克隆和表达了水肿病大肠杆菌的致病因子F18ab 菌毛的主要亚单位FedA全基因(包括信号肽序列),并与现有的另一致病因子志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因(stx 2eA)连接,然后进行联合表达。同时用已制备的抗Stx 2eA 单克隆抗体和抗F18ab菌毛单克隆抗体对联合表达的融合蛋白质进行检测鉴定。     

猪水肿病大肠杆菌主要毒力因子的B细胞表位预测与验证

猪水肿病是由产类志贺毒素大肠杆菌引起的仔猪的一种急性、致死性传染病,其发病率为10%～35%,致死率在90%以上.研究表明,致猪水肿病大肠杆菌主要产生F18ab菌毛和类志贺毒素II型变异体(SLT-IIe)两类毒力因子,F18菌毛中的FedF是发生粘附作用所必需的结构单位,同时高度保守;SLT-IIe的B亚基具有免疫原性,是水肿病毒素保护性抗原所在处,且其核苷酸序列的同源性达到了100%[1-3].本研究旨在对致猪水肿病的两种主要毒力因子FedF和SLT-IIeB进行生物信息学分析,预测其可能的B细胞表位,人工合成短肽,分别与抗F18ab菌毛蛋白和抗大肠杆菌水肿毒素的猪血清进行反应,鉴定短肽的反应原性:与载体蛋白(BSA)偶联后免疫小鼠,测定反应原性,以期获得既有反应原性又有免疫原性的多肽,为猪水肿病表位疫苗及多表位疫苗的研制奠定基础.     

大肠杆菌F18菌毛的研究进展

F18菌毛是致猪水肿病的产Vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）与某些产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的主要毒力因子之一，现已知，F18菌毛抗原有F18ab,F18ac两种血清型变异，F18ab即为F107，而18ac则包括近来才发现并命名的菌毛2134P及定居因子8813。现将有关F18菌毛的研究进展概述如下。     

黏附素菌毛F18的研究近况

由表达F18菌毛的大肠杆菌(VTEC、ETEC)引起的仔猪水肿病和断奶腹泻仍然是养猪业中一个没有完全解决的问题,给畜牧业生产带来的损失仍然不可低估[1,2,3,4].F18菌毛有F18 ab和F18 ac二个抗原变种,它们主要介导产肠毒素大肠杆菌(ETEC)与产vero细胞毒素大肠杆菌(VTEC)在仔猪肠道内的定居.F18菌毛作为这些病原细菌重要致病因子,国内外对其研究方兴未艾.目前,F18菌毛的研究已经较为深入,从一般形态水平到基因控制水平都有了较大突破.本文就国外和国内的研究概况作一综述,以供相关研究人员参考.     

猪水肿病大肠杆菌分离、鉴定及药敏试验

本实验从疑似猪水肿病的病例分离到5株大肠杆菌,O抗原鉴定结果表明所有菌株均为O139血清型;应用F18ab菌毛单克隆抗体对这5株大肠杆菌能否表达F18ab菌毛进行了鉴定,结果表明其中2个菌株能表达F18ab菌毛;利用聚合酶链式反应(PCR)对志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)操纵子基因保守区进行了扩增,结果发现在能表达F18ab菌毛2个菌株中可扩增一段特异性序列。以上数据表明这2株大肠杆菌为致仔猪水肿病大肠杆菌。药敏试验表明这两株菌株均对氟哌酸、妥布霉素、庆大霉素、利福平等抗生素高度敏感。     

猪源大肠杆菌fedA基因的克隆及鉴定

断奶仔猪腹泻（post—weaning diarrhea，PWD）和猪水肿病（porcine edema disease，ED）是导致仔猪死亡的重要传染性疾病。PWD和ED分别由肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）和志贺氏毒素大肠杆菌（verotoxigenic Escherichia coli，VTEC）引起。ETEC和VTEC等病原菌除了产生毒素外，还同时具有菌毛粘附因子。F18菌毛是病原菌主要的粘附因子，介导细菌对小肠黏膜上皮细胞表面受体的粘附，在PWD和ED的发生中起着决定性的作用，是引起疾病的主要毒力因子之一。     

猪水肿病新型亚单位菌苗对小鼠的效力研究

利用大肠杆菌表达猪水肿病大肠杆菌的水肿毒素SLT-IIe B,提取表达产物包涵体,再加入自行分离的我国流行的猪水肿病大肠杆菌Ee株(O139),和油乳佐剂乳化后制成亚单位菌苗,免疫昆明鼠,间隔2 w加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素的ELISA抗体和Ee株的凝集效价,第2次免疫2 w后用5LD50的猪水肿病大肠杆菌Ee株进行攻毒。结果显示,亚单位菌苗组与灭活菌苗组ELISA抗体水平有显著性差异,两种疫苗对Ee的保护力分别为90%和70%。本研究表明新型亚单位菌苗模式对同型菌株具有较好的保护力,为进一步研制高效的亚单位菌苗打下基础。     

致断奶仔猪腹泻、水肿病大肠杆菌F18菌毛a因子单克隆抗体的研制及其初步应用

以表达 F18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 F18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 F18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定分泌针对 F18ac菌毛和 F18ab菌毛共同抗原表位 a因子的单克隆抗体。细胞培养上清对 F18ac菌毛参考菌株 2 134和 F18ab菌毛参考菌株 10 7/ 86的直接凝集价均可达 1∶ 8,腹水单抗直接凝集效价可达 1∶ 10 2 4 ,而与猪源产 F4、F5、F6和 F4 1粘附素大肠杆菌菌株、鸡源产 型菌毛大肠杆菌菌株及沙门氏菌不发生凝集反应。免疫印迹试验结果显示 ,腹水单抗可同时特异识别 F18ac菌毛 170 0 0和 F18ab菌毛 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 2 15株断奶仔猪腹泻大肠杆菌分离株进行了检测 ,结果上述分离株 TSB培养物的 F18菌毛的检出率为13.4 % ,TSA培养物的检出率为 8.4 %。F18菌毛阳性分离株的 O血清型除了常见血清型 O139、O14 1外 ,还有非常见血清型 O10 7、O131和 O9等。TSB培养物的 F18菌毛检出率明显高于 TSA培养物的检出率 ,表明 F18菌毛在 TSB培养基中比在 TSA培养基上更容易表达 ,TSB培养基是适合 F18菌毛检测、流行病学调查的培养基     

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在该地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%～1.84%,死亡率为0.07%～0.56%,病死率为16.0%～35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生,一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌,经O血清型鉴定,5株为O139,2株为O45,O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,共6个分离株带有SLT-2e基因,其中O139分离株5株,O55分离株1株,其余6株均带STb基因。12个分离株中,单独表达F18菌毛的4株(O1392株,O45、O119各1株),F5 F411株(O93),F41 F181株(O139),F5 F41 F182株(均为O139)。经药敏试验,多数分离菌株对壮观霉素和新霉素高度敏感。     

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月～2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查，发现猪水肿病在海安地区呈零星散发性发生，发病率为0.31％～1．84％，死亡率为0．07％—0．56％，病死率为16．0％～35．0％。水肿病主要侵害仔猪，育成猪也偶有发生，一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌，经O血清型鉴定，5株为0139，2株为O45，O55、O93，O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa，STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测茵毛，共6个分离株带有SLT-2e基因，其中O139分离株5株，055分离株1株，其余6株均带STb基因。12个分离株中，单独表达F18菌毛的4株(O1392株，O45、O119各1株)，F5 F411株(O93)，F41 F181株(O139)，F5 F41 F182株(均为O139)。经药敏试验，多数分离株对壮观霉素和新霉素高度敏感。     

海安县猪水肿病的流行病学调查

对江苏省海安县2003年各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查，发现猪水肿病在海安地区呈零星散发，发病率为0．29％～1．36％，死亡率为0．08％～0．35％。从疑似猪水肿病的病料中分离到22株大肠埃希氏茵，其中12株经血清型鉴定，O139 5株，O15 2株，O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因和黏附素单抗检测菌毛，发现6个分离株带有SLT-Ⅱe基因，其余6株带有STb基因。单独表达F18茵毛的4株，F5 F41的1株，F41 F18的1株。F5 F41 F18的2株。药敏试验结果表明，多数分离株对恩诺沙星、庆大霉素、阿米卡星和壮观霉素高度敏感。     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

断奶仔猪源大肠杆菌F18菌毛的分子流行病学研究

利用F18菌毛a因子单克降抗体以及已建立的鉴定F18菌毛及其亚型的双重PCR法,对来自断奶仔猪水肿病和／或腹泻病例的60株VTEC、24株VTEC／ETEC以及24株ETEC的进行了F18菌毛检测,以了解F18ab^＋和F18ac^＋大肠杆菌在江苏省断奶仔猪群的分子流行病学。结果表明：通过F18菌毛a因子单克隆抗体,可检测出52株大肠杆菌为F18^＋,检出率为48．15％;而通过双重PCIL方法,共检测出63株大肠杆菌为F18^＋,检出率为58．33％,其中53株（49．07％）为F18ab^＋10株（92．6％）为F18ac^＋。另外还发现：在VTEC、VTEC／ETEC以及ETEC的菌株之间,这2种F18菌毛亚型的分子流行病学是不同的。在VTEC中,F18ab^＋,菌株37株（61．67％）,未发现F18ac^＋菌株;在VTEC／ETEC中,F18ab^＋菌株15株（62．50%）,F18ac^＋菌株8株（33．33％）;而在ETEC中F18ab^＋菌株只有1株（4．17％）,F18ac^＋菌株只有2株（8.33％）。以上数据表明：④PCR法检测F18菌毛优于单抗法;②F18菌毛是VTEC／ETEC、VTEC的重要致病因子,而在ETEC中则明显低于VTEC／ETEC和VTEC;⑧F18ab^＋菌株一般为SLT-IIe^＋,而F8ac^＋菌株一般为STI^＋。     

致猪水肿病大肠杆菌毒力因子二重PCR检测方法的建立及应用

本试验分别针对志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)B亚基和F18ab茼毛fedA亚基保守序列设计2对引物,扩增长度分别为230 bp和510 bp,通过条件优化,建立了一种快速鉴定致猪水肿病大肠杆菌同时确定其致病因子的二重聚合酶链式反应(PCR)检测方法,对阳性扩增产物测序,结果都有很高的保守性.特异性试验和灵敏性试验表明:与其他6种猪常见致病菌(产毒多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门菌和链球菌)无交叉反应,菌体直接扩增法最低检出量为101cfu(D600为0.002).通过该二重PCR检测方法对2004-2006年自猪肺、脑组织中分离的216株大肠杆菌进行鉴定,得到6株致猪水肿病大肠杆菌,其中3株既具有菌毛又产水肿毒素,另外3株仅产水肿毒素;菌毛阳性菌株占毒素阳性菌株的50%.     

猪水肿病发病机理研究进展

猪水肿病主要发生于断奶后2周内的仔猪,是常见的一种急性致死性传染病。该病是由利用其菌毛(F18ab)黏附于小肠上皮细胞,并产生类志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)的产类志贺毒素大肠埃希菌引起的一种肠毒血症。仔猪断奶后的免疫能力,营养水平和遗传抗性是导致猪水肿病的主要影响因素。文章着重阐述了猪水肿病的致病机理,为该病的预防和治疗提供重要的理论依据。     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86SLT-ⅡeA基因的克隆与表达

为了克隆与表达致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位(SLT-ⅡeA)基因,试验以F107/86为模板,PCR扩增去掉信号肽的935 bp的SLT-ⅡeA亚单位基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ与SalⅠ位点之间并测序,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:对筛选出的阳性重组质粒pGEX-SLT-ⅡeA-4测序并与GenBank登录的M36727序列比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-SLT-ⅡeA经SDS-PAGE分析其大小为58.3 ku;Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫原性。说明试验所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白。     

F18ac菌毛A亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的F18ab菌毛A亚单位(FedA/ab)的基因(fedA/ab)[1],设计一对引物,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌2134P株[2]、8199株[3]、8813株[3]中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒T2134PA、T8199A、T8813A.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该3个序列大小均为516bp,与fedA/ab(513bp)具有较高的同源性,分别为96.3%、96.5%、95.9%,推导的Fed/ac氨基酸序列与FedA/ab同源性分别为93.0%、93.6%、92.4%.数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛A亚单位(FedA/ac)的基因(fedA/ac).     

苏太仔猪FUT1基因M307位点多态性与F18大肠杆菌抗病相关性的体外鉴定

采用PCR-RFLP方法检测了江苏苏太断奶仔猪FUT1基因M307位点等位基因多态性分布,在所检的49头仔猪中,GG基因型个体16头,AG基因型19头,AA基因型14头。在此基础上,制备上述不同基因型个体仔猪小肠上皮细胞,分别与表达F18ab菌毛的野生型大肠杆菌、表达F18ac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠杆菌和V型系统表面分泌表达F18abFedF亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附试验和黏附抑制试验。研究结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述3种大肠杆菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。将上述3种大肠杆菌分别与抗F18ab菌毛高免血清、F18ac菌毛高免血清及抗F18abFedF亚单位单因子血清作用后,则失去黏附仔猪肠上皮细胞能力。上述结果对苏太猪从体外试验上证明了FUT1基因M307位点多态性与断奶仔猪腹泻和水肿病存在着直接的相关性。