大豆EST-SSR标记开发及与Genomic-SSR的比较研究*

本研究对458220条大豆EST序列进行SSR搜索,共检测出EST-SSR序列39989条, 经拼接得到无冗余EST-SSR序列8190条,包括357种重复基元。其中二、三核苷酸重复基元类型居多,分别占无冗余EST总数的11.13%和16%,统计得到二核苷酸重复类型12种,三核苷酸重复类型60种。以含有简单重复序列的无冗余EST序列设计200对引物,其中148对引物有清晰且单一条带扩增产物,以30份大豆品种资源进行引物筛选,获得多态性引物31对。以21份大豆不同基因型的基因组DNA为模板选取30对显示多态性的大豆EST-SSR引物和30对大豆基因组SSR引物进行扩增,带型统计结果显示：大豆EST-SSR与基因组SSR在供试基因型间多态性指数均值分别为0.55 和0.44,二者揭示的多态性水平差异不大。从而说明利用生物信息学方法基于大豆EST开发SSR标记是切实可行的,大豆EST-SSR可以用于大豆遗传多样性分析,是大豆DNA分子标记体系的一个重要补充。     

甜菜EST-SSR引物的开发与应用

利用NCBI公共数据库现有的甜菜(Beta vulgaris L.)表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据信息,开发了甜菜EST-SSR标记。在所有的29830条甜菜EST序列中共确认得到20109条非冗余EST序列,总长为11287.6kb。在含有微卫星重复的6951条EST序列中按照SSR引物设计要求,最终获得了2845个EST-SSR,平均每3.96 kb含有1个SSR。EST-SSR的分布频率和特征分析表明,A/T单碱基重复最多,其次是AAG/CTT三核苷酸重复,AG/CT二核苷酸重复,ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重复最少。随机合成了100对SSR引物,并分别选用6个甜菜品种进行多态性检验,将其按遗传相似性分为两组,多态信息含量(polymorphism information content,PIC)平均值为0.47。本研究证实这种全新的开发甜菜SSR标记的方法具有高效、多态性较高的特点,在甜菜遗传多样性分析、功能基因定位、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。     

小麦穗部组织 EST-SSR标记引物开发及其在小麦遗传多样性分析中的应用

为了筛选光温敏雄性不育系（PTGMS）小麦穗部的EST-SSR 分子标记,探讨其EST-SSR标记用于小麦品种遗传差异研究的可行性,用SSRSCAN软件对PTGMS小麦穗部的3 264条EST序列进行SSR 位点查找,结果得到108条含有SSR标记的序列。设计64对引物并进行PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳。结果显示,64对引物中有41对能在42个小麦品种中扩出PCR条带,有多态性条带的为36对,具有较高的扩增效率。聚类分析结果显示,42个小麦品种的遗传相似系数在0.64~0.87之间,3个PTGMS小麦品种具有较高的遗传相似系数。     

大麻SSR标记的开发及指纹图谱的构建

表达序列标签（expressed sequence tags,EST）是开发SSR标记的重要资源.本研究从NCBI中大麻EST数据库中检索到1114个SSR,分布于989条EST序列中,占EST总数的7.66％.其中三、六核苷酸重复基元类型居多,分别占EST-SSR总数的39.84％和34.56％,统计得到三核苷酸重复类型47种,六核苷酸重复类型113种.利用部分EST-SSR序列设计49对SSR引物,其中40对引物有扩增产物,占所设计引物总数的81.63％.进一步用这些引物在24个大麻品种进行多态性检测,29对引物显示多态性,占可扩增引物的72.5％.利用E-7、E-8、E-11、E-18、E-21、E-39及E-48共7对引物构建了24份供试材料的SSR指纹图谱.本研究结果证明了基于大麻EST信息建立SSR标记是一种有效而又可行的方法,并且为这些品种的真伪鉴定和保护提供科学依据.     

甘蔗EST-SSR标记的开发和多样性分析

运用生物信息学分析方法对甘蔗(Saccharum spp.)的282 809条表达序列标签(ESTs)进行分析,共获得Unigene 138 590条,发掘出分布于10 086条Unigene的10 505个微卫星(EST-SSR)位点,SSR发生频率为7.26%,平均9.22 kb出现1个SSR。在7个杂交甘蔗品种中,三核苷酸基元的SSR数量最多(74.95个/Mb),其次为二核苷酸基元的SSR(22.95个/Mb),二者占总数的90.27%。以CCG/CGG、AG/CT为重复基元的SSR是最常见的EST-SSR类型,富含G/C的EST-SSR占据极明显的优势。与拟南芥和水稻cDNA序列内SSR的比较表明,富含G/C的SSR可能是禾本科植物SSR的一个共同特点。研究发现,SSR在EST与基因组序列之间以及在不同甘蔗品种之间的分布存在差别,具有丰富的多样性。此外,从EST数据分析获得杂交甘蔗品种的16个保守基因,从中发掘了9个SSR位点。最后,利用Primer3和e-PCR软件设计了一批具有物种特异性和通用性的EST-SSR PCR引物,相关数据可以通过http://59.50.66.49/SSR/sugarcane/sugarcane.EST-SSR.tgz链接从因特网下载。该研究结果可为开展甘蔗遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子辅助育种提供参考。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、 品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR 搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。 基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主 导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核 苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个 SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物 表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12 个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实用性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及 其相关近缘物种的遗传变异。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异。     

大豆EST序列长度与SSR特性的关系

为了分析大豆EST-SSR的特征和比较其不同长度EST序列中的SSR特性,从NCBI下载了大豆EST序列,应用SSRIT搜索SSR,分析了20 183个无冗余的EST序列,发现了1747个EST序列(8.66%)含有SSR,长度超过400 bp的EST序列含SSR的比例为10.05%,而长度在400 bp以下的EST序列SSR的比例为4.74%.二核苷酸和三核苷酸SSR是大豆EST-SSR的主要类型,分别的60.45%和37.04%,最常见的SSR基元是:AT、AG、AAT、AC、AAG、ACG.在1798个EST-SSR中,51.45%的长度大于12 hp,13.35%长度大于20 hp.推断NCBI大豆EST数据库中含有12 3527个SSR,大豆EST-SSR可用于大豆分子标记,具有重要的开发价值,为有针对性设计EST-SSR引物奠定基础.     

基于瓠瓜转录组测序的EST-SSR标记的开发及其应用

为丰富瓠瓜分子标记库、开发瓠瓜SSR标记、寻找有效的瓠瓜种质资源鉴定方法,利用MISA软件对瓠瓜转录组测序获得的87 518条unigene序列进行筛选,共检测出11 029个SSR位点,发生频率为9.85%,分布距离为平均每8.3 kb有1个SSR 位点。其中只包含1个SSR位点的unigene 序列有6759条,其发生频率为7.72%;有1858条unigene序列含有2个及2个以上的SSR位点,发生频率为2.123%;有920条unigene序列属于混合形式的SSR标记,频率为1.051%。瓠瓜转录组中优势重复基序为单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR位点的55.51%、25.41%和17.07%。A/T、AG/CT和AAG/CTT分别是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的98.22%、55.39%和39.86%。用Primer 3.0共设计出8617对SSR引物,利用6对条带清晰、多态性稳定的SSR引物构建了36个品种的指纹图谱,部分位点具有高度的一致性,说明基因来源范围较小。聚类分析显示,在相似系数为0.68时将36个瓠瓜品种分为6类。其表明我国瓠瓜品种资源遗传多样性非常狭窄,利用现有瓠瓜资源开展品种选育潜力有限,应加强对野生特异种质的引进与发掘利用。利用瓠瓜转录组数据进行SSR标记开发,获得的SSR位点能为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。     

石斛兰亲缘关系的SSR分析

利用SSR标记分析石斛兰品种遗传多样性及亲缘关系,为合理利用石斛兰种质资源、培育观赏价值高的石斛兰新品种提供依据.从22对SSR引物中筛选获得11对多态性引物,对28个市场流行石斛兰品种的基因组DNA进行扩增.共获得158条多态性位点,平均每个引物产生14个多态性条位点.材料间遗传相似系数变化范围为0.04～0.85,根据SSR标记的结果,采用UPGMA法进行聚类分析,在相似系数0.295处将28份石斛兰种质分为5类.结果表明,石斛兰品种具有丰富的遗传多样性,遗传基础较宽;SSR标记技术很好地从分子水平上揭示石斛兰品种的遗传背景、亲缘关系.     

芒果转录组中SSR位点信息分析与引物筛选

利用MicroSAtellite软件分析筛选芒果转录组中的SSR位点。结果表明,在54 207条Unigene中共搜索得到4 103个SSR位点,出现频率为7.57％。其中,三核苷酸重复为主导重复类型,占SSR总数的38.19％,其次是单核苷酸重复（26.91％）。AG/CT和AAG/CTT分别是二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。根据SSR侧翼序列共设计6 915对SSR引物,随机挑选了230对进行PCR检测,获得93对多态性引物。由此可见,芒果转录组数据可以作为大量开发SSR标记的资源,这些SSR标记也将有助于芒果遗传多样性和种质资源鉴定的研究。     

胡椒EST-SSR标记的开发和应用

通过分析NCBI数据库中胡椒转录组数据,共得到unigene 23 524条,其中618条unigene中检测到643个EST-SSR位点,SSR发生频率为2.63%,平均分布距离为12.86 kb。在643个EST-SSR中,二、三核苷酸重复是主要重复类型,分别占27.84%和69.36%,其中(AG/CT)n、(AAG/CTT)n出现频率最高,(NNN/NNN)5类型占EST-SSR位点的42.90%。利用PRIMER3.0设计358对引物,随机合成45对引物,并选用其中11对扩增较好的多态性引物,对43份胡椒种质的遗传多样性进行初步检测,构建聚类分析树状图。结果说明,胡椒EST-SSR标记的开发是可行的,并能够有效的用于胡椒遗传分析研究,具有较高的应用价值。     

Large scale identification of SSR marker in perilla by next generation sequencing

Perilla frutescens (L.) is an edible, medicinal crop, and most popular in East Asia. Its molecular breeding and research are hampered by the paucity of molecular markers. Simple sequence repeat (SSR) markers are ubiquitous and widely used in eukaryotic genomes. EST-SSRs identification of perilla was performed in 116,387 reads generated by Illumina paired-end sequencing technology. In total 25,449 unigenes containing SSR and 33,867 SSR loci were identified, and 19,400 primer pairs were designed. Polymorphism of SSR primers was conducted by searching for insertions and deletions (INDELs), and 1,567 unique SSRs were predicted. Totally, 200 SSR primer pairs were selected for polymorphic validation among 23 perilla accessions. Results showed that 175 primer pairs produced amplicons, and 30 pairs exhibited polymorphism. Polymorphic ratio was higher by using INDEL method than using conventional primers. Phylogenetic analysis showed the 2 distinct groups: P. frutescens var. frutescens and P. frutescens var. crispa. Wrinkled leaf trait and seed trait were distinct between these 2 groups. However, no clear leaf color or geographic relationship was detected. The large scale development and identification of SSR marker in this research laid a foundation for genetic analysis and marker assisted breeding of cultivated perilla.     

Identification of EST–SSRs and molecular diversity analysis in Mentha piperita

EST sequences of Mentha piperita available in the public domain(NCBI) were exploited to develop SSR markers. A total of 1316 ESTs were assembled into 155 contigs and 653 singletons and of these, 110 sequences were found to contain 130 SSRs, with a frequency of1 SSR/3.4 kb. Dinucleotide repeat SSRs were most frequent(72.3%) with the AG/CT(43.8%)repeat motif followed by AT/AT(16.2%). Primers were successfully designed for 68SSR-containing sequences(62.0%). The 68 primers amplified 13 accessions of M. piperita and 54 produced clear amplicons of the expected size. Of these 54, 33(61%) were found to be polymorphic among M. piperita accessions, showing from 2 to 4 alleles with an average of2.33 alleles/SSR, and the polymorphic information content(PIC) value varied between 0.13 and 0.51(average 0.25). All the amplified SSRs showed transferability among four different species of Mentha, with a highest in Mentha arvensis(87.0%) and minimum in Mentha citrata(37.0%). The newly developed SSRs markers were found to be useful for diversity analysis, as they successfully differentiated among species and accessions of Mentha.     

小麦EST-SSRs分子标记的特性及其遗传作图

为了解普通小麦EST来源的微卫星的多样性,从大约1 000个包含微卫星的ESTs中设计了300对引物,研究和评估了它们的多态性水平,并且将多态性标记加入到现有的遗传图谱中.在五种不同类型的重复单元中,三个碱基的重复单元出现最多,占到77%.几乎所有的EST SSRs标记(99.3%)的重复单元都含有G-C碱基对.37.4%的微卫星都是四次重复.对于扩增和多态性,300对引物中有60对没有扩增,21.3%的扩增引物没能产生预期的扩增片断.58%的标记至少在所用8个材料的一个中显示出多态性.W7984和Opata组合表现出最高的多态性水平.大多数普通小麦EST-SSRs标记的重复次数小于10,并且4次重复是最为普遍的.81个新的EST-SSR位点被添加到两个已有的参照遗传图谱中(62个加到ITMI,19个加到CTCS).研究结果表明小麦EST-SSRs标记展示了一些不同于基因组微卫星的特异特征,在标记发展和其他遗传应用中,这就使得它们能够成为一种非常有价值的资源.