禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

藏鸡和隐性白羽鸡感染柔嫩艾美耳球虫后免疫相关基因的表达变化分析

试验旨在从免疫遗传学的角度初步探讨藏鸡（TC）和隐性白羽鸡（RWC）对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）易感性差异的分子机制,分别用1×10⁵个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染对球虫具有抗性的藏鸡和易感的隐性白羽鸡。应用实时荧光定量PCR检测藏鸡和隐性白羽鸡感染前0 d和感染后第2、4、6和8天脾脏、盲肠、胸腺、法氏囊中γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-16、Toll样受体（TLR3）和TLR15免疫相关基因的转录水平变化。结果显示,藏鸡脾脏IFN-γ、IL-2、IL-16及TLR3、TLR15免疫相关基因转录水平于感染后第4和8天明显上调,隐性白羽鸡则无明显变化。藏鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第2天显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第4天起显著上调（P<0.05）,其余免疫相关基因变化幅度不大;隐性白羽鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第8天显著上调（P<0.05）,IL-2在感染后第2天起显著上调（P<0.05）,IL-16在感染后第6天起显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第2和8天显著上调（P<0.05）,TLR15变化幅度不大。各免疫相关基因在2个品种鸡胸腺和法氏囊中均出现上调或下调,但除藏鸡法氏囊TLR3和TLR15转录水平变化幅度相对较大外,其余免疫相关基因与感染前相比变化幅度不大。以上结果显示,球虫感染主要导致藏鸡和隐性白羽鸡脾脏和盲肠中的各免疫相关基因出现显著变化,表明宿主的遗传背景在一定程度上可影响球虫感染的免疫应答。     

GnIH过表达载体构建及其对小鼠睾丸间质细胞的作用研究

本试验通过构建GnIH过表达载体,探究其对小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞系）的凋亡效应及睾酮合成的调节作用。从6~8周雄性小鼠睾丸组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR扩增并纯化GnIH基因,应用T4连接酶将其连入PLVX-IRES-ZsGreen1载体,进一步转化到感受态菌中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染TM3细胞系72 h,分为空质粒组和GnIH过表达组,通过显微镜观察细胞荧光、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法、ELISA法和流式细胞术检测GnIH表达水平、细胞凋亡率及相关凋亡基因表达变化、睾酮分泌水平和睾酮合成酶基因表达水平。结果显示,GnIH扩增片段序列与参考序列一致,将GnIH过表达质粒转染至TM3细胞系72 h后,可见高强度绿色荧光,过表达组中GnIH基因水平极显著升高（P<0.01）,表明GnIH过表达载体构建成功且在TM3细胞系中高表达。转染72 h后,与空质粒组相比,过表达组中细胞凋亡率极显著升高（P<0.01）,凋亡基因P53和Bax/Bcl-2表达量比值也极显著升高（P<0.01）。与空质粒组相比,过表达组中睾酮浓度极显著降低（P<0.01）。与此同时,睾酮合成相关酶基因P450 scc mRNA表达量极显著降低（P<0.01）,StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表达量显著降低（P<0.05）,17β-HSD mRNA表达量在两组间无显著性差异（P>0.05）。综上所述,在体外培养的TM3细胞中过表达GnIH能诱导TM3细胞凋亡、抑制睾酮分泌且降低睾酮合成相关酶的基因表达水平,推断GnIH在小鼠睾丸间质细胞生长和睾酮合成过程中发挥负调控作用。本研究可为揭示GnIH在雄性哺乳动物生殖调控过程中的作用提供科学理论依据。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。     

鸡IL-6和IL-18基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立鸡白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素18(IL-18)基因实时荧光定量PCR(Realtime FQ-PCR)检测方法。应用RT-PCR方法扩增鸡外周血淋巴白细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)的IL-6和IL-18基因片断,分别克隆至pGM-T载体上,将浓度梯度的IL-6和IL-18基因的重组质粒DNA进行实时荧光定量PCR,并建立相应的标准曲线。经PCR、双酶切和测序分析显示,成功地构建了重组克隆质粒pGM-T-IL-6和pGM-T-IL-18。标准曲线分析显示,IL-6和IL-18基因标准曲线的Ct值与其标准品浓度的对数值之间有良好的线性关系,IL-6和IL-18检测的灵敏度均达到10拷贝/μL。为下一步应用实时荧光定量PCR技术检测IL-6和IL-18基因的转录水平奠定了基础。     

金黄色葡菌球菌脂蛋白对M1型小鼠骨髓源巨噬细胞免疫作用的影响

本研究旨在阐明金黄色葡萄球菌脂蛋白对M1型小鼠骨髓源巨噬细胞免疫作用的影响，为金黄色葡萄球菌致病性研究提供理论参考。以金黄色葡萄球菌野生株SA113（WT SA113）和SA113 lgt：：ermB脂蛋白表达缺失菌株（SA113Δlgt株）体外感染M1型小鼠骨髓源巨噬细胞，分为3组：空白对照组、WT SA113感染组（MOI：3：1）、SA113Δlgt感染组（MOI：3：1）。采用ELISA法检测M1型小鼠骨髓源巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、趋化因子（RANTES）和白细胞介素10（IL-10）的水平，实时荧光定量PCR检测Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）和含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）基因的表达，免疫荧光法检测脂蛋白对M1型小鼠骨髓源巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌作用的影响。结果显示，与空白对照组相比，WT SA113感染组和SA113Δlgt感染组均可显著上调M1型小鼠骨髓源巨噬细胞中TNF-α、RANTES、IL-10分泌量以及WT SA113感染组TLR2、NLRP3基因表达水平（P<0.05），而TLR4基因表达量显著降低（P<0.05）；与WT SA113感染组相比，SA113Δlgt感染组M1型小鼠骨髓源巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、RANTES、IL-10分泌量以及TLR2（12 h除外）、NLRP3基因表达水平显著降低（P<0.05）。免疫荧光结果显示，M1型巨噬细胞对SA113Δlgt株的吞噬作用显著低于对WT SA113株的吞噬作用（P<0.05）。综上，金黄色葡萄球菌的脂蛋白在M1型小鼠骨髓源巨噬细胞中主要通过激活TLR2和NLRP3受体，诱导细胞因子TNF-α、IL-1β、RANTES和IL-10的产生和释放。     

鸢尾黄素作为MgrA抑制剂对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的治疗作用

本研究旨在从中药小分子库中筛选出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）转录调控因子MgrA的单体抑制剂,并探讨其对金黄色葡萄球菌主要毒力因子的影响及对小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的治疗作用。使用荧光各向异性分析法进行抑制剂的筛选,通过实时荧光定量PCR、溶血试验及纤维蛋白原黏附试验考察药物对MrgA调控的相关毒力基因转录表达及对溶血和黏附的抑制作用,采用热稳定迁移试验对其抑制机制进行初步探讨,最后通过建立小鼠肺炎模型评估鸢尾黄素对金黄色葡萄球菌诱导的小鼠肺炎的治疗作用。结果显示,鸢尾黄素作为MgrA的抑制剂,在不影响细菌生长的低浓度下（IC₅₀=20.35 μg/mL）就能显著抑制MgrA的活性（P<0.05）;实时荧光定量PCR结果显示,鸢尾黄素可显著降低fnba基因的转录水平（P<0.05）,极显著降低hla和RNAⅢ基因的转录水平（P<0.01）,同时极显著上调ebh、srap和spa基因的转录水平（P<0.01）;溶血试验显示,8 μg/mL鸢尾黄素可极显著抑制USA300菌株的溶血作用（P<0.01）;纤维蛋白原黏附试验证实32 μg/mL鸢尾黄素可极显著抑制USA300菌株的黏附活性（P<0.01）;热稳定迁移试验揭示了鸢尾黄素是通过与MgrA结合从而抑制其活性。小鼠肺炎试验结果显示,鸢尾黄素能极显著提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率（P<0.01）,极显著减少其肺脏载菌量（P<0.01）,并减轻小鼠肺脏组织的病理损伤和炎症反应。以上结果表明,鸢尾黄素能通过抑制转录调控因子MgrA的活性对金黄色葡萄球菌感染引起的小鼠肺炎起到治疗作用,可作为开发治疗金黄色葡萄球菌感染的先导化合物,并为以毒力因子MgrA为靶标的药物研发提供了理论依据。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因绝对定量PCR方法的建立及应用

研究旨在建立一种检测禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p27(ALV-p27)基因实时荧光定量PCR的方法。通过设计ALV-p27特异性的荧光定量PCR引物扩增基因并制备质粒标准品,同时建立检测病毒衣壳蛋白p27基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法检测6日龄胚胎感染,1日龄出壳雏鸡不同组织中p27基因的分布和表达情况。结果表明,ALV-p27基因在1日龄雏鸡脑组织中表达水平最高,而在胸腺组织中表达水平最低。研究建立的检测ALV-p27基因绝对定量PCR方法为进一步研究其生物学功能提供了一种技术手段。     

禽腺病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

禽腺病毒4型(FAdV-4)是心包积水综合征的重要病原。本研究拟建立FAdV4荧光定量PCR检测方法,为FAdV4感染的流行病学调查、早期诊断、疫病净化提供技术手段。根据GenBank中的禽腺病毒4型六邻体(hexon)基因序列,设计一对引物,扩增hexon基因,将目的基因与载体pEASY-T3连接,构建重组阳性质粒pEAST-T3-H,利用所制备的质粒pEAST-T3-H为模板,对PCR反应体系、反应条件进行优化。建立了禽腺病毒4型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,检出的标准品的敏感性为1.7×10拷贝/μL,优于常规的PCR检测方法。该方法与其他禽病病毒均无交叉反应。表明该方法具有特异型强、灵敏度高、重复性好的特点,可用于临床样本的检测。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

饲粮精氨酸水平对肉仔鸡免疫功能及其抗FAdV-4影响的研究

本试验旨在研究饲粮精氨酸水平对肉仔鸡免疫功能及其抗禽腺病毒I群4型（fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）的影响。选取1日龄罗斯（Ross）308肉仔鸡300只,随机分为5组（每组5个重复,每个重复12只）,设置5个饲粮精氨酸水平组,分别为0.96%、1.20%、1.44%、1.68%和1.92%,试验鸡饲养至21日龄,各重复随机选取4只测定血清免疫指标和免疫相对器官指数。随后各重复再次随机选取6只,并分为感染组和对照组,感染组肌肉注射FAdV-4 NP毒株0.2 mL（TCID₅₀=10^-6.23/0.01 mL）,对照组肌肉注射等量灭菌生理盐水,感染2 d后,统计死亡率、发病率,ELISA测定肝组织iNOS水平、qPCR测定肝iNOS mRNA表达量及病毒载量。结果表明：1）饲粮精氨酸水平为1.44%、1.68%和1.92%时,均能显著提高脾脏指数（P<0.05）且精氨酸水平为1.68%能显著提高胸腺指数（P<0.05）,而精氨酸水平为0.96%会显著降低脾脏、胸腺和法氏囊指数（P<0.05）。2）1.68%精氨酸水平组能显著提高血清球蛋白（GLO）、IgG水平和球蛋白/白蛋白（G/A）比值（P<0.05）;精氨酸水平为0.96%显著降低血清球蛋白和IgG水平（P<0.05）。3）精氨酸水平为0.96%可显著降低肉仔鸡血清中IL-1β、TNF-α、iNOS和NO水平（P<0.05）,而1.68%和1.92%精氨酸水平组均能显著提高肉仔鸡血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和iNOS水平（P<0.05）。4）肉鸡感染FAdV-4后,0.96%精氨酸水平组的死亡率会显著高于1.20%、1.44%、1.68%和1.92%组（P<0.05）。5）ELISA测定结果显示,1.44%、1.68%和1.92%精氨酸水平组能显著提高感染后的肝组织iNOS水平。6）1.44%、1.68%和1.92%精氨酸水平组均能显著提高肝iNOS mRNA表达水平（P<0.05）;肉鸡感染FAdV-4,iNOS mRNA水平均会显著降低（P<0.05）,1.44%、1.68%和1.92%精氨酸水平组能提高感染FAdV-4后肝iNOS mRNA水平（P<0.05）并显著降低肝的病毒载量（P<0.05）。由此可见,肉仔鸡饲粮中精氨酸的不足会降低其机体的免疫功能及抗FAdV-4病毒能力。提高肉仔鸡饲粮中精氨酸水平不仅能提高免疫器官指数、血清免疫因子水平及肝iNOS mRNA表达水平,降低肝的病毒载量,从而提高机体免疫功能和抗病毒能力。     

雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT—PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的sYBRGreenI实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1～20日龄雏鸡不同肠段组织81基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致（扩增曲线斜率差〈0．1）,满足使用比较Ct值法对B1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

中草药复方防治雏鸡沙门氏菌病的研究

为了探明中草药复方对雏鸡感染肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis）的防治效果,本研究选取黄连、鹿蹄草、白头翁等23味中草药组成的复方中草药制剂进行体外和体内抑菌试验。体外抑菌试验中草药复方的抑菌直径为17.4 mm,说明沙门氏菌对其高度敏感。体内抑菌试验中,将中草药复方以低（0.1%）、中（0.3%）、高（0.5%）3个剂量进行治疗试验,结果表明,肠炎沙门氏菌感染后,与对照组相比,3个试验组均极显著提高了试验鸡的成活率（P<0.01）,显著降低了试验鸡的料重比（F/G）（P<0.05）,中、高剂量组的平均日增重（ADG）显著高于对照组（P<0.05）,中剂量组的平均日采食量（ADFI）显著低于对照组（P<0.05）。3个试验组试验鸡的脾脏指数、白细胞数量（WBC）、血小板计数（PLT）、免疫球蛋白A（IgA）、IgG、IgM、补体C4含量均显著低于对照组（P<0.05）,而胸腺指数、法氏囊指数、红细胞数量（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、红细胞压积（HCT）均显著高于对照组（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,抗菌肽基因（CATH1、CATH2、CATH3）在脾脏、胸腺和法氏囊中的表达量均不同程度地高于对照组。综合试验结果,日粮中添加中草药复方可以降低雏鸡感染肠炎沙门氏菌后的死亡率,提高雏鸡的免疫能力和抗菌能力,改善生长性能,其中,中剂量组（0.3%）的防治效果最佳。     

不同来源传染性支气管炎病毒诱导SPF鸡发病的免疫机制研究

试验旨在探讨不同来源的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)诱导SPF鸡发病的免疫机制。选用140只1日龄SPF白来航鸡,随机分为4组,3组攻毒组通过滴鼻点眼途径分别接种鸡源IBV强毒株、鸡源IBV弱毒株和野鸡源IBV毒株3个毒株,对照组以同种方式接种等量灭菌的磷酸盐缓冲液。在感染后12 h、36 h、72 h、7 d和14 d,每组随机选取5只进行剖检,并分别采集法氏囊、肾脏和气管组织,剩余鸡用于观察临床症状、发病及死亡情况。应用实时荧光定量PCR检测攻毒后不同时间点采集的各组织中IBV的病毒载量、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及部分细胞因子(白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN))表达量的变化。结果显示,感染不同来源IBV毒株之后仅鸡源IBV强毒株感染组SPF鸡出现抑郁、翅膀下垂、甩头等典型的临床症状,且在感染后5~10 d共有7只死亡,死亡率为20%。病理剖检发现,感染鸡源IBV强毒株的鸡肾脏肿大、尿酸盐沉积和有花斑样病变,而感染野鸡源IBV毒株、鸡源IBV弱毒株和对照组的鸡无明显的眼观病变。实时荧光定量PCR结果显示,在鸡源IBV强毒株组的法氏囊、肾脏和气管3个组织中均检测到病毒。对照组和野鸡源IBV毒株组中均未检测到病毒,鸡源IBV弱毒株组只在部分组织中检测到病毒。在感染后72 h,鸡源IBV强毒株组与其他各组相比,TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7和TLR15基因在法氏囊中的表达量均显著升高(P<0.05),IL-6和IFN-β参与更强烈的抗病毒免疫反应;在感染后7 d,鸡源IBV弱毒株组与其他各组相比,肾脏中TLR2、TLR3、TLR15、TLR21、IL-6和IL-18基因表达量均显著升高(P<0.05)。野鸡源IBV感染后36 h法氏囊组织中IFN-γ基因表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,3个IBV毒株中仅鸡源IBV强毒感染引起SPF鸡典型临床发病症状与可视组织病变,且可提高SPF鸡组织中免疫相关因子的基因表达量。本研究结果揭示,不同来源的IBV对SPF鸡的不同致病性与其感染诱导的免疫反应不同有关。     

鸡脂滴包被蛋白基因内含子6多态性与胴体及脂肪性状的相关性研究

试验采用PCR-RFLP方法检测脂滴包被蛋白(perilipin,PLIN)基因内含子6在济宁百日鸡、莱芜黑鸡等4个地方鸡种和1个培育品系中的遗传多态性,分析了多态位点不同基因型与鸡胴体及脂肪性状的相关性。结果发现,在5个供试群体中检测到1个多态位点,测序证实为新发现的鸡PLIN基因2 467 bp处G→A突变,该突变位点在供试群体中检测到3种基因型:A1A1、A1A2和A2A2,2个等位基因:A1和A2。等位基因A1在所有供试群体中均表现为优势等位基因。关联分析结果表明,PLIN基因2 467 bp位点对鸡部分胴体性状和脂肪性状影响显著(P<0.05)。多重比较结果表明,A1A1基因型个体活体重、屠体重、全净膛重、腹脂重和腹脂率均显著高于A2A2基因型个体(P<0.05)。A1A2基因型个体的胸肌肌内脂肪含量显著高于A1A1和A2A2基因型个体(P<0.05)。研究结果表明,PLIN基因对鸡胴体及脂肪性状有一定影响。     

禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

饲粮中添加丁酸梭菌和丁酸钠对产蛋鸡生产性能和蛋品质的影响

试验旨在研究在产蛋鸡饲粮中添加丁酸梭菌和丁酸钠对不同品种产蛋鸡产蛋率、鸡蛋雀斑、暗斑以及蛋品质的影响。选择270日龄狼山鸡、芦花鸡、北京油鸡各320只,随机分成2组,每组8个重复,每个重复20只鸡,对照组（CON）饲喂基础饲粮,试验组（EXP）饲粮中添加100 mg/kg丁酸梭菌＋500 mg/kg丁酸钠。预饲期3 d,试验期为5周。试验结果表明,与对照组相比,①试验组狼山鸡、芦花鸡、北京油鸡产蛋率分别提高12.5%、12.0%和24.9%（P<0.01）;②试验组狼山鸡鸡蛋雀斑3级率下降34.2%（P<0.05）,芦花鸡和北京油鸡鸡蛋各级雀斑率均无显著差异（P>0.05）,狼山鸡、芦花鸡、北京油鸡鸡蛋各级暗斑率均无显著差异（P>0.05）;③试验组狼山鸡蛋重降低1.7%（P<0.05）,蛋形指数增加2.3%（P<0.05）;芦花鸡蛋重增加1.5%（P<0.05）;北京油鸡蛋白高度增加13.9%（P<0.05）,哈氏单位增加4.7%（P<0.05）。综上,在产蛋鸡基础饲粮中添加一定量的丁酸梭菌和丁酸钠,可以提高狼山鸡、芦花鸡、北京油鸡产蛋率,对改善狼山鸡鸡蛋的雀斑也有一定的作用,且有助于提高芦花鸡、北京油鸡的蛋品质。     

鸡TGF-β1对大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞的影响

旨在研究鸡转化生长因子-β1（transfer growth factor-β1,TGF-β1）对大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞的影响。通过ELISA方法检测鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染DF1细胞后鸡TGF-β1表达量的变化,参考GenBank中鸡TGF-β1序列构建鸡TGF-β1的过表达和干扰表达载体,将构建成功的TGF-β1重组表达载体转染DF1细胞后48 h在荧光显微镜下观察其转染效率,荧光定量PCR检测鸡TGF-β1 mRNA水平表达量的变化,ELISA方法检测鸡TGF-β1胞外蛋白表达量的变化,通过黏附试验检测鸡TGF-β1对致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞的影响。结果显示,NDV感染DF1细胞后,鸡TGF-β1胞外表达量显著高于未感染细胞的表达量（P<0.05）,经酶切测序鉴定TGF-β1干扰表达和过表达重组载体构建成功。转染鸡TGF-β1重组过表达载体细胞的TGF-β1 mRNA和胞外蛋白表达量均显著高于未转染细胞（P<0.01）,致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌对细胞的黏附率均显著高于未转染细胞（P<0.01）,转染鸡TGF-β1重组干扰表达载体细胞的mRNA和胞外蛋白表达量均显著低于未转染细胞（P<0.01）,致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌对细胞的黏附率均显著低于未转染细胞（P<0.01）。综上,NDV感染DF1细胞后,鸡TGF-β1的表达量增加,鸡TGF-β1可促进致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞,这为进一步研究鸡TGF-β1在家禽病毒感染继发细菌性疾病中的作用提供试验基础。