基于ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列兔肝球虫PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18S rRNA和28S rRNA进行序列比对分析,在18S rRNA 3’端和28S rRNA 5’端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列,其大小为1178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8S rRNA为155 bp,ITS2为600 bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列同源性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。     

黄艾美耳球虫单卵囊分离及PCR鉴定

为了获得纯种黄艾美耳球虫,从张家口某兔场的兔粪中分离黄艾美耳球虫孢子化卵囊,单卵囊接种无球虫兔,以饱和盐水漂浮法收集子代卵囊,利用CTAB法提取黄艾美耳球虫卵囊基因组DNA,并根据Gen Bank中发表的艾美耳属球虫保守序列设计引物,PCR扩增ITS并测序,设计特异性引物鉴定黄艾美耳球虫。结果表明:黄艾美耳球虫ITS1序列长330 bp,5.8S r DNA序列长157 bp,ITS2序列长522 bp。在黄艾美耳球虫ITS1/2序列高变区设计种特异性引物,与大型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫无交叉反应。说明建立的鉴定黄艾美耳球虫的PCR方法灵敏、特异。     

斯氏艾美耳球虫ADF基因部分序列的克隆与分析

为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。     

3种兔球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

采用单卵囊分离法从河北某兔场分离大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫,接种无球虫兔后获得大量纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将3种球虫18S rDNA测序结果与GenBank中发布的兔球虫18S rDNA序列用DNAStar软件进行比对。使用MEGA4.0软件对兔球虫18S rDNA进行同源性比较,并绘制遗传进化树。结果表明,大型艾美耳球虫扩增出大小为1 521bp的18S rDNA片段;黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫均扩增出大小为1 520bp的18S rDNA片段。序列比对结果显示,3种河北株兔球虫与GenBank中相应的3种兔球虫18S rD-NA(EF694016、EF694011、EF694012)相似性分别为99.6%、99.6%和100%。3种河北株兔球虫序列和GenBank中兔球虫18S rDNA序列(EF694007-EF694017)位于一个单系集群。     

黄艾美耳球虫河北株18SrDNA部分序列测定及系统发育分析

为了进一步确定黄艾美耳球虫河北株虫种,试验根据GenBank中发表的黄艾美耳球虫18SrDNA基因序列设计引物,建立PCR方法对黄艾美耳球虫河北株基因片段扩增、测序,并进行系统发育分析.结果表明:扩增出大小为1 465bp的清晰条带;黄艾美耳球虫河北株18S rDNA序列测定结果与GenBank中的黄艾美耳球虫EF69...     

3种兔球虫ITS-1序列测定与系统发育分析

从河北省兔场分别单卵囊分离孢子化大型艾美耳球虫卵囊、黄艾美耳球虫卵囊及肠艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔后获得纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18SrDNA和5．8SrDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫ITS-1片段,产物纯化后测序。将3种球虫ITS-1测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离比较,绘制系统发育树。结果表明,大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫河北株分别扩增出424、455、434bp的ITS-1片段。大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾关耳球虫河北株与GenBank中发布的同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为97．4％、97．9％和96．9％。系统发育树显示兔球虫ITS-1序列形成1个单系群,该单系群根据寄生部位分为2个姊妹群。     

鸡六种艾美耳球ITS-1的克隆和序列分析

为对上海地区分离的6种鸡艾美耳球虫内转录间隔区1(ITS-1)进行克隆和序列分析,探索ITS-1区域序列在鸡球虫分类学中的作用,利用一对属特异性引物,对上海地区分离的6种球虫的ITS-1序列进行PCR扩增,扩增产物克隆到pMD18-T后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行系统进化树分析.结果显示,巨型艾美耳球虫有大小分别为547bp和422bp两条PCR扩增条带;和缓艾美耳球虫有大小为627bp和493bp两条PCR扩增条带;其他4种球虫均为一条PCR扩增条带,大小分别为柔嫩艾美耳球虫668bp,毒害艾美耳球虫691 bp,堆型艾美耳球虫507 bp,早熟艾美耳球虫541 bp.6种球虫序列之间的同源性为34%～52%.系统进化分析显示,各个种分别与GenBank中下载的对应球虫种在同一分支上.     

甘肃省部分地区兔艾美耳球虫分子流行病学调查研究

为调查甘肃省兔艾美耳球虫的感染状况、虫种分布和风险因素,本研究从甘肃省平凉、酒泉、武威地区采集5个不同品种兔的592份粪便样品,提取粪便样品中的基因组DNA,基于艾美耳球虫核糖体第1内转录间隔区（ITS1）设计引物,采用特异性PCR扩增兔艾美耳球虫基因片段。结果发现,兔艾美耳球虫的总感染率为50%（296/592）;通过序列比对分析共鉴定出7种不同的兔艾美耳球虫,分别是大型艾美耳球虫（24.5%,145/592）、肠艾美耳球虫（4.1%,24/592）、中型艾美耳球虫（11.5%,68/592）、穿孔艾美耳球虫（19.8%,117/592）、维氏艾美耳球虫（24.5%,145/592）、小型艾美耳球虫（4.9%,29/592）和盲肠艾美耳球虫（0.84%,5/592）;以大型艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫为优势虫种,同时发现所调查的兔中有多重感染的情况,最多包括四重感染。统计学分析显示,地区因素（P<0.05）、品种因素（P<0.05）和年龄因素（P<0.05）是影响兔艾美耳球虫感染率的风险因素,提示应该针对这3种因素采取有效的防控措施。本研究结果揭示了甘肃省部分地区养殖场兔的艾美耳球虫感染率、虫种分布和感染率的风险因素,为预防和控制甘肃省地区养殖兔的艾美耳球虫病提供了科学依据。     

10株巨型艾美球虫rDNA-ITS-1部分序列测定与分析

用一对种特异性引物,对国内10株巨型艾美球虫ITS．1区进行PCR扩增,对扩增产物纯化、测序与分析,并用DNAStar软件对所检测的10株巨型艾美球虫与GenBank中的所有巨型艾美球虫的ITS．1相应序列进行系统发生进化关系分析。结果显示,扬州株、龙岩株和福州株的ITS-1部分序列片段长度为152bp,其余各株均为151bp。10株巨型艾美球虫的同源性为90．7％～100％,在构建的系统发生进化树中分成2大系群,凤阳株形成一个单系群,其余9株为另一系群。虫株间的亲缘关系与地理位置不尽一致,与免疫交叉保护力无相关性。     

2种鹅球虫18S rDNA基因克隆测序与系统发育分析

在分析了多种艾美耳球虫18S rDNA序列的基础上,设计1对艾美耳属球虫的通用引物,分别对鹅艾美耳球虫(E.anseris)和赫尔曼艾美耳球虫(E.hermani)18S rDNA部分序列进行PCR扩增、克隆和测序,并用DNAstar软件对这2种鹅球虫与15种艾美耳球虫的18S rDNA序列进行同源性分析,最后以火鸡组织滴虫为外类群,采用邻接法构建了2种鹅球虫与29种艾美耳亚目原虫的18S rDNA序列系统进化树。结果显示:鹅艾美耳球虫和赫尔曼艾美耳球虫的18S rDNA部分序列长度分别为1 695和1 696 bp。虫种间的相似性以2种鹅球虫最高,其次为鹅球虫与鹤球虫。在系统发育树中,艾美耳属球虫与成囊类球虫各形成一个单系分支;锦鲤的艾美耳球虫与其他动物的艾美耳球虫形成姊妹群关系;湿地鸟类的艾美耳球虫聚合为一分支,鸡形目和哺乳类动物的艾美耳球虫形成另一分支。本研究提示18S rDNA序列可用于鹅球虫的分类鉴定。     

桑属植物ITS序列研究与系统发育分析

用PCR产物直接测序法对桑属的 9个种 3个变种共 13份桑种质和构属构树的ITS序列进行了测定。结果表明 :桑属植物ITS1长度平均约为 189bp;桑属 5 8SrRNA为 15 2bp ;ITS2长度平均为 2 12bp ;桑属植物ITS序列G +C含量为 6 0 %左右。用DNASTAR软件构建了桑属植物ITS序列的系统发育树 ,并探讨了参试桑种质的亲缘关系。     

Evolution of coccidial infection in commercial and domestic rabbits between 1982 and 1986

Caecal samples were collected from 751 domestic rabbits of various origin and from 1229 diarrhoeic rabbits issued from 61 commercial rabbitries. They were screened for coccidiosis. In 1982, the year of introduction of the anticoccidial robenidine in commercial rabbit feeds, a dramatic decrease of coccidial infection ratio was detected in commercial rabbitries: only 6% of samples contained greater than 100 oocysts per gram against 85% in 1979, when sulphaquinoxaline/pyrimethamine was used. Only Eimeria magna, E. media and E. perforans were detected, whereas the highly pathogenic species E. flavescens and E. intestinalis had disappeared from commercial units. After 4 years of continuous use of robenidine, infection ratio rose progressively, although still far below the 1979 levels. Most of the other species reappeared, but only in very low proportions (1-4% of samples). The percentage occurrence of E. magna, E. media and E. perforans on the contrary rose progressively to 25, 26 and 34%, respectively, suggesting drug resistance. In domestic rabbitries, the incidence of coccidial infection was markedly higher and all nine species of Eimeria were detected. Eimeria magna, E. media and E. perforans were very common, E. flavescens, E. intestinalis, E. piriformis and E. stiedai were less common, whereas E. irresidua and E. coecicola were relatively rare. Notwithstanding the lower activity of robenidine against E. stiedai, no rise of hepatic coccidiosis became evident.     

Assessment of primers designed for the subspecies-specific discrimination among Babesia canis canis, Babesia canis vogeli and Babesia canis rossi by PCR assay

Canine babesiosis is an infectious disease caused by either Babesia gibsoni or Babesia canis protozoans. The latter is also classified under three different phylogenetic groups, referred to as subspecies B. canis canis, B. canis vogeli and B. canis rossi. The objective of the present study was to validate and standardize a PCR assay to discriminate the organisms at the subspecies level. First, the reference sequences of the 18S rRNA, 5.8S rRNA and 28S rRNA genes, including the internal transcribed spacer 1 (ITS1) and 2 (ITS2) of the most common species and subspecies of the genus Babesia were retrieved from the GenBank database. Subspecies-specific primers (BAB3, BAB4 and BAB5) and one genus-specific primer were designed from the alignment of the sequences. The PCR assays were evaluated in three different combinations of primer pairs in order to assure complete specificity for each reaction. The results of the tests had demonstrated effectiveness of the novel primer pairs BAB1/BAB3, BAB1/BAB4 and BAB1/BAB5 for the amplification of the subspecies-specific target fragments of 746 bp (B. c. canis), 546 bp (B. c. vogeli) and 342 bp (B. c. rossi) by PCR. The original enzymatic amplification assays with novel primers reported in this paper were confirmed to be a reliable tool for the specific discrimination among B. canis subspecies by single-step PCR assays.     

Cloning and nucleotide sequencing of the second internal transcribed spacer of ribosomal DNA for three species of Eimeria from chickens in Taiwan

Coccidiosis of chickens caused by protozoan parasites of the genus Eimeria (Coccidia: Eimeriidae) is an enteric disease that results in great economic losses throughout the world, including Taiwan. Using polymerase chain reaction (PCR) with primers specific for the second internal transcribed spacer (ITS-2) of ribosomal DNA (rDNA), three species of Eimeria, E. tenella, E. maxima, and E. acervulina have been successfully characterised from chickens in Taiwan. The sizes of PCR products from various isolates representing these three species were between 370 and 580 base pairs (bp). After cloning and sequencing of the PCR products, high nucleotide sequence identity (96.8-100%) was observed within a species. In addition, ITS-2 nucleotide sequences for E. tenella had higher homology (98.5-99.3%) than E. maxima (81.6-96.5%) when compared with appropriate sequences deposited in GenBank. To our knowledge, this is the first report of a 412-bp ITS-2 sequence for E. acervulina from chickens.     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

3种冠环线虫rDNA-ITS的PCR扩增及序列分析

本试验利用PCR扩增3种冠环线虫5个样品的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S片段,将PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定和分析。序列比对和分析结果显示,所测样品ITS1-5.8S-ITS2的长度范围为748~843 bp,总变异位点(包括gaps)119个,简约信息位点18个;其中ITS1和ITS2的长度范围分别为367~370 bp和228~320 bp,变异位点分别为14个和105个,简约信息位点均为9个。所有测试样品的5.8S片段完全相同,长度为153 bp。5条序列ITS1区的G+C含量(48.0%~48.5%)明显高于ITS2区(37.7%~40.3%)。通过序列两两比对,3种冠环线虫ITS1和ITS2的种间差异性分别为1.9%~3.5%和5.6%~31.8%;而种内差异性分别为0~0.5%和0~0.9%。并且所测序列与GenBank中已知序列的同源性为99.07%~99.41%。本研究认为,ITS序列可以作为冠环线虫种类鉴定的分子标记。     

大熊猫蛔虫ITS及5.8SrDNA序列的克隆与分析

基于核糖体DNA第一与第二转录间隔序列以及5.8S序列,以分离自广州动物园大熊猫体内的蛔虫为研究对象,用保守引物NC_5和NC_2对核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区ITS-1,ITS-2及5.8S序列进行PCR扩增,扩增后的片段纯化后克隆至pGEM-Teasy载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定及分析,鉴定大熊猫蛔虫的种类。结果显示,目的片段总长为910 bp,2个不同样品之间的ITS及5.8S序列没有差异,与GenBank~（TM）中的拜林蛔线虫（Baylisascaris transfuga）、猪蛔虫（Ascaris suum）和人蛔虫（Ascaris lumbricoides）的ITS序列相似性分别为96.6%、82.9%和82.7%。结果表明,此次分离的大熊猫蛔线虫可能为拜林蛔线虫。     

3株柔嫩艾美耳球虫28SrRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28S rRNA基因部分序列,并与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172 bp的28S rRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28S rRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。     

鸡蛔虫凉山州分离株ITS和5.8SrDNA序列测定及种系发育分析

应用保守引物BD1和BD2对7个鸡蛔虫凉山州分离株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S rDNA序列进行PCR扩增和序列测定,并用ITS-1、ITS-2序列重构鸡蛔虫与其他蛔虫的系统发育关系。测序结果显示所获得的鸡蛔虫ITS及5.8S rDNA序列大小为974~989 bp,同源性为98.9%~100.0%。其中ITS-1、5.8S rDNA和ITS-2片段大小分别为473~481、157和337~359 bp,同源性分别为98.5%~100.0%、100.0% 和98.5%~100.0%。系统发育树显示所有鸡蛔虫分离株聚在同一分支,能与其他蛔虫相区别。研究结果表明,鸡蛔虫的ITS-1、ITS-2序列种内变异小,但种间差异大,故可作为分子标记用于鸡蛔虫的虫种鉴定,为鸡蛔虫的分子分类、分子流行病学调查和种群遗传的进一步研究奠定基础。