猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.     

鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2亚型病毒(AIV H9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。【结果】成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kD,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和IBDV活性明显高于单一rChIFN-α的抗病毒活性;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。IFN-α活性单位为200IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡和胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。合适剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性。【结论】rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,这为进一步研究以rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

QIAexpress系统高效表达鸡γ-干扰素cDNA的研究

深入进行基因工程鸡干扰素的研究 ,将前期工作所得到的 p GEM T Easy/ Ch IFN-γ2重组质粒中的 Ch IFN- γ2基因亚克隆到表达质粒 p QE30上 ,构建了重组表达质粒 p QE- Ch IFN- γ2 ,转化大肠杆菌 M1 5,构建了高效表达重组蛋白的双质粒 QIAexpress系统。经对重组蛋白的可溶性判定、包涵体的溶解、纯化、复性及活性测定 ,结果表明 Ch IFN-γ2的表达水平为 2 2 % ,包涵体的纯度为 80 % ,生物学活性为 3 2 0 0～ 6 40 0 U.mg-1 。本方法可供大量制备活性鸡γ-干扰素参考     

"病毒克"颗粒剂对NDV在鸡胚成纤维细胞中增殖的影响

为评价中药“病毒克”颗粒剂体外抗新城疫病毒(NDV)的活性,采用细胞培养技术,通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测“病毒克”颗粒剂在鸡胚成纤维细胞(CEF)中对新城疫病毒增殖的影响。结果表明“病毒克”颗粒剂对CEF的半数中毒质量浓度(TC50)为61.35 mg/mL,抗NDV的半数有效质量浓度(EC50)为3.2 mg/mL,治疗指数(TI)为19.2,“病毒克”颗粒剂对新城疫病毒具有直接灭活作用和阻断其感染CEF的作用,并存在明显的量效关系(P<0.01);在感染后9 h内以14 mg/mL剂量给予“病毒克”颗粒剂,对新城疫病毒复制的抑制率为42.8%~76.5%。说明“病毒克”颗粒剂对新城疫病毒在鸡胚成纤维细胞中的增殖具有明显的抑制作用。     

灰树花胞外多糖发酵液的抗病毒作用研究

以一株灰树花菌株发酵胞外多糖在鸡胚水平上进行了抗新城疫病毒作用研究。将新城疫病毒分别和灰树花发酵胞外多糖混合接种到9~11日龄鸡胚,继续孵化,记录鸡胚死亡时间并测定死亡鸡胚尿囊液血凝价。结果表明,与对照组相比,通过发酵制备的灰树花发酵胞外多糖对新城疫病毒有很好的抑制作用,减缓并降低了鸡胚的死亡,降低了血凝效价,对新城疫病毒有一定的杀灭作用。     

鸡白细胞干扰素的研究

本研究采用鸡血细胞和鸡脾细胞诱生外源性干扰素。对不同种(株)的病毒、病毒剂量、营养液等因素对干扰素产生的影响进行了比较,测定了鸡白细胞干扰素的产生曲线和干扰素预处理鸡脾细胞后对干扰素产量的影响,也进行了干扰素提纯方法及其临床应用的研究。 试验结果表明,在I系新城疫病毒、F系新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、仙台病毒四种(株)病毒中,以F系新城疫病毒诱导干扰素的能力较强;病毒剂量对干扰素的产量影响不大;RPMIl640细胞培养液比0.5％水解乳旦Hanks液为好;鸡脾细胞在F系新城疫病毒作用后4小时即产生干扰素,12～20小时达到最高产量;干扰素预处理鸡脾细胞后,引起干扰素产量明显下降,采用硫酸铵盐析法将干扰素进行部份提纯,可提高纯度19.8倍,平均回收率为75.3％;干扰素能明显地减轻感染了传染性囊病的鸡的腔上囊的病变程度,看来对鸡传染性囊病会具有一定的防治作用。     

TLRs信号通路和促炎症细胞因子基因在鸡胚成纤维细胞感染新城疫病毒过程中的表达分析

【目的】研究新城疫病毒对鸡胚成纤维细胞中TLRs抗病毒信号通路和促炎症相关细胞因子的诱导作用。【方法】采用分离培养的原代鸡胚成纤维细胞感染中等毒力的新城疫病毒,并在感染后的4、8、12、16、24h收集细胞,利用定量PCR检测TLRs信号通路及促炎症相关细胞因子在细胞新城疫病毒感染过程中的表达变化。【结果】结果显示,TLR3、TLR7、TLR15,及其衔接蛋白基因MYD88、TRIF,以及下游基因IFN-α、IFN-β、Mx的表达量在病毒感染后呈现出显著上调(P0.05)。同时促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量在病毒感染后也表现出显著上调(P0.05)。【结论】研究表明,在鸡胚成纤维细胞对新城疫病毒的识别过程中,由TLR3、TLR7、TLR15介导抗病毒信号通路,同时诱导产生促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,并在新城疫病毒诱导的炎症反应过程中发挥重要的作用。     

莪术油注射液鸡胚接种抗新城疫病毒的研究

[目的]探讨莪术油对新城疫病毒的抑制和杀灭作用。[方法]用鸡胚培养法和血凝试验,测定莪术油对鸡新城疫病毒增殖的抑制作用。[结果]莪术油对鸡胚无毒性作用;莪术油与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制鸡新城疫病毒在鸡胚中的增殖。[结论]结果为莪术油在兽医临床上的应用提供了理论依据。     

重组酵母鸡α干扰素的诱导表达及其抗MDV、NDV能力

【目的】获得鸡α干扰素重组酵母菌诱导表达的最佳诱导时间和甲醇的体积分数,并测定诱导表达产物对鸡马立克氏病毒(MDV)和鸡新城疫病毒(NDV)的抑制能力。【方法】挑取2个鸡α干扰素重组酵母菌单菌落至BMGY培养基中培养,待菌液OD600为4左右时,分别转接至BMMY培养液诱导,1瓶每隔12 h补加1次体积分数0.5%甲醇,另1瓶每隔12 h补加1次体积分数1%甲醇,于24,48,72 h收集样品,备SDS-PAGE检测用。根据不同时间(24,48,72,96 h)诱导上清液表达量的差异,留用表达量最高时段的上清液,经初步纯化后,利用鸡胚成纤维细胞(CEF),分别测定重组酵母鸡α干扰素抑制MDV及NDV的能力。【结果】鸡α干扰素重组酵母菌在每隔12 h补加1次体积分数1%甲醇诱导48 h时,或每隔12 h补加1次体积分数0.5%甲醇诱导72 h时,重组酵母鸡α干扰素表达量均达到最高;且诱导上清液具有较好地抑制MDV、NDV的能力。【结论】获得了鸡α干扰素重组酵母菌小量发酵的最佳条件;获得的重组酵母鸡α干扰素对MDV和NDV有明显的抑制作用。     

鸡干扰素γ（c-IFNγ）重组蛋白的稳定性研究

以保护鸡胚成纤维细胞（CEF）抵御新城疫病毒（NDV）侵袭的能力为主要检测指标,考察鸡干扰素γ（c-IFNγ）的热稳定性、酸碱稳定性及冻融耐受性。在37℃及以上的热处理中,c-IFNγ样品迅速失活,其中60℃处理1h活性即降低约70％;酸性环境中的样品极不稳定,在pH-2的液体制剂中1h,蛋白质全部失活,但在碱性制剂中...     

秦岭大熊猫IFN-γ基因的表达及其生物活性分析

【目的】探讨大熊猫秦岭种群和四川种群IFN-γ基因的差异,获得具有生物活性的秦岭大熊猫重组γ干扰素蛋白。【方法】采集秦岭大熊猫血样,采用RT-nested PCR技术扩增秦岭大熊猫IFN-γ基因,将其克隆到表达载体pET32a中,转入DH-5α,进行菌液PCR和双酶切鉴定,经序列测定与分析,构建表达质粒pET32a-IFN-γ,将其转入BL21(DE3)受体菌后,用IPTG诱导表达秦岭大熊猫IFN-γ蛋白。对重组IFN-γ蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析后,用镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白。采用淋巴细胞增殖试验检测重组IFN-γ的活性。【结果】大熊猫秦岭种群和四川种群的IFN-γ基因序列在434位核苷酸处存在差异,秦岭大熊猫的为G,而四川大熊猫的为C;氨基酸序列相同。重组IFN-γ主要以可溶性形式存在,其分子质量为35.3 ku,约占菌体总蛋白的20%;纯化的可溶性蛋白经SDS-PAGE分析,纯度可达90%以上;重组IFN-γ具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性。【结论】获得的重组IFN-γ蛋白表达量高且具有生物学活性。     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定

本试验将已构建的鸡α-干扰素重组酵母表达质粒pPIC-ChIFNα克隆至Pichia pastorisGS115基因组中,从阳性转化子中筛选出2株能高效表达鸡α-干扰素的重组酵母菌株,并对表达产物进行了纯化和抗病毒活性的测定。结果表明,Pichia pastoris表达的重组ChIFNα具有较高的抗病毒活性,其活性单位为570×104U/ml,结合蛋白定量计算其比活性为2 980×104U/mg。     

新城疫病毒诱导黄粉虫抗病毒肽的效果分析

观察鸡新城疫病毒(NDV)诱导黄粉虫是否产生抗鸡新城疫病毒肽.先用鸡胚培养鸡新城疫病毒以扩增病毒,然后提取病毒液备用,接着用鸡新城疫病毒液接种刺伤黄粉虫幼虫,2～3天后提取黄粉虫体内的抗病毒物质,测定其血凝效价和鸡新城疫病毒诱导鸡胚发病抑制试验结果.结果表明黄粉虫抗病毒肽在血凝抑制试验中的效价为1:64;在鸡新城疫病毒诱导鸡胚发病抑制试验中有一定效果,但不明显.     

重组鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活苗的免疫增强作用

为研究重组鸡γ-干扰素(Chicken interferonγ,ChIFN-γ)对禽流感灭活疫苗的免疫增强效果,使用重组鸡γ-干扰素作为免疫佐剂,联合禽流感灭活疫苗采用胸部肌肉注射的方式免疫SPF雏鸡,免疫后每周测定血清抗体效价、免疫器官T、B淋巴细胞转化水平,攻毒后计算攻毒保护率。结果表明,鸡γ-干扰素提高了血清抗体水平,免疫器官T、B淋巴细胞转化水平和攻毒保护率,与疫苗组相比多数指标差异显著(P0.05)。鸡γ-干扰素对H5亚型禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用。     

鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达

[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。     

鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探

为了研究鸡α干扰素(ChIFNα)基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交(dot-blot)检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。     

鸡IFN-γ表达载体的构建

[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。