骨组织中总RNA提取方法的改进

为了改进经典Trizol法,我们建立了一种有效提取矿化骨组织中总RNA的新方法。在Trizol裂解时加入等体积水饱和酚,在异丙醇沉淀时加入高浓度的盐溶液,并重复氯仿抽提1次。通过紫外分光光度法和1%甲醛变性凝胶电泳法分析提取RNA,以其逆转录cDNA为模板,经PCR扩增雌激素受体(ER)基因予以鉴定。结果,本方法获得的总RNA A260/A280达到1.85以上,电泳条带显示RNA完整,RT-PCR结果显示其纯度较好。结果表明,改良Trizol法是一种从矿化骨组织中提取总RNA的高效便捷的方法。     

改良TRIzol法高效提取东北林蛙皮肤总RNA

目的:建立一种从两栖动物皮肤组织中提取高质量总RNA的方法。方法:改良传统TRIzol法,提取皮肤总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度和得率,1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。结果:改良方法提取的总RNA,其A260/A280值在1.8～2.1之间,A260/A230大于2;琼脂糖凝胶电泳显示清晰的28s rRNA和18s rRNA条带,且28s rRNA条带亮度约为18s rRNA的2倍。结论:改良TRIzol法提取的总RNA纯度高、完整性好、杂质少、得率大,易于操作掌握,可以用于相应的分子生物学试验。     

荔枝果皮总RNA提取方法的筛选

以三月红荔枝果皮为试验材料，通过采用改良CTAB法、SDS法、改良SDS法、改良Bugos法和RNAplant plus Reagent试剂盒（TIANGEN公司）提取总RNA，采用浓度检测、纯度检测、RT-PCR等方法进行提取结果检测，进而筛选出最佳的提取方法。结果表明，这五种方法都能从三月红荔枝果皮中提取出总RNA，但总RNA浓度和纯度有明显的差异。其中采用改良Bugos法、改良SDS法和RNAplant plus Reagen试剂盒提取RNA的浓度较高；采用改良CTAB法和RNAplant plus Reagen试剂盒提取的总RNA纯度较高，完整性较好。采用SDS法、改良SDS法和改良Bugos法所提取的荔枝果皮总RNA纯度低，降解严重。经RT-PCR验证，采用改良CTAB法和RNAplant plus Reagen试剂盒均能扩增得到200bp的18sRNA编码基因片段。综合以上各项检测的结果，改良CTAB法为提取荔枝果皮总RNA的最佳方法，总RNA质量和得率满足后续分子生物学实验的需要。     

柱花草总RNA提取方法比较

以热研2号柱花草（Stylosanthes guianensis Reyan No.2）叶片为材料,利用紫外分光光度计和凝胶电泳法比较SDS 酚抽提法、CTAB法、Trizol试剂盒和柱式植物RNAout试剂盒法提取柱花草总RNA的质量和纯度。结果表明,改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA的OD260 nm/OD280 nm分别是1.85和1.93,OD260 nm/OD230 nm均大于2.0。凝胶电泳结果表明,改良CTAB法及柱式植物RNAout试剂盒法均有28S rRNA和18S rRNA两条清晰的条带,且无降解。其他两种方法获得的RNA品质较差,有降解和弥散现象。将改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA逆转录成cDNA,cDNA能扩增出一条清晰的β actin基因片段,进一步证明了改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的总RNA具有很高的纯度,其中柱式植物RNAout试剂盒法的效果好于改良CTAB法。     

苜蓿总RNA提取方法比较研究

以苜蓿叶片为材料,利用紫外分光光度计和凝胶电泳法比较了改良CTAB法、异硫氰酸胍法、SDS法、Tris-热硼法和尿素法等五种方法提取的苜蓿总RNA的质量和纯度.结果表明:改良CTAB法提取的RNA的OD260nm/OD230nm大于2.O并且OD260am/OD280nm接近1.8,具有较高的纯度.凝胶电泳结果表明,改良CTAB法有28SrRNA和18S rRNA两条清晰的条带,且无降解;其它四种方法获得的RNA品质较差,有降解和弥散现象.将改良CTAB法提取的RNA逆转录成cDNA,经RAPD扩增后出现4条清晰的条带,进一步证明了改良CTAB法提取的总RNA具有很高的纯度,可以满足进一步分子生物学研究的要求.     

高山离子芥磷脂酶D活性测定及酶动力学分析

高山离子芥（Chorispora bungean）是一种高抗逆的多年生高山草本植物,具有特殊的分子及生理抗逆响应机制。磷脂水解酶磷脂酶D （PLD）是重要的跨膜信号转导酶。以高山离子芥愈伤组织为试材,利用酶联免疫分光光度计法,优化磷脂酶D活性测定体系,建立了在25℃反应温度条件下,200 μL反应体系中,膜蛋白的含量35 μg、反应时间30 min、pH为7.0的缓冲液系统最适合高山离子芥愈伤组织磷脂酶D活性测定体系,分析表明不同膜结合态磷脂酶D的酶动力学特征存在差异,为进一步探讨磷脂酶D在高山离子芥响应逆境胁迫中的作用奠定基础。     

猪精子RNA提取的初步研究

实验采用Trizol一次法或试剂盒提取猪精子的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中鱼精蛋白(PRM-1)的mRNA;使用不同数量的精子,检测在本实验条件下能扩增出PRM-1带所需要的最小精子数量;通过OD260/280的测算,判断不同提取方法所得RNA的纯度;通过琼脂糖电泳得到精子RNA与睾丸、卵巢组织RNA的电泳图。实验结果表明:在使用RNA沉淀剂时,1.51×107精子可检测到PRM-1的mRNA,不使用沉淀剂则需要3.02×107精子才检测到;使用Trizol一次法提取的精子总RNA纯度较常规Mini试剂盒(W6221)高;本实验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖凝胶电泳图。初步研究的结果表明,Trizol一次法可用来提取精子总RNA供进一步研究;猪精子RNA的28S和18S片段与睾丸、卵巢组织无明显差异。     

意大利蜜蜂大龄幼虫总RNA提取方法优化

本研究通过优化Trizol法提取了意大利蜜蜂蜂王大龄幼虫的总RNA,并利用1%琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测RNA质量和完整性,结果表明优化后的方法提出的总RNA质量高、完整性好。     

低温胁迫下内源性ROS对磷脂酶D活性影响的研究

低温(4℃,0℃和-4℃)处理高山离子芥(chorispora bungeana),研究低温胁迫引发的内源性ROS对高山离子芥叶中线粒体膜结合态磷脂酶D(Phospholipase D PLD)活性的影响,以期揭示内源性ROS对高山离子芥叶中线粒体膜结合态PLD活性的调控机制。结果表明,在4℃,0℃和-4℃处理下,高山离子芥叶中H2O2的含量和PLD活性均高于空白对照组。在正常条件下,用不同浓度H2O2处理后,PLD活性高于空白对照组。当添加NADPH氧化酶抑制剂(diphenylene iodonium DPI)处理后,在3个温度胁迫下PLD活性低于对照组,在该条件下线粒体膜结合态Ca~(2+)含量高于对照组。当用DPI+CaCl2处理后,PLD活性较添加DPI处理组高,而添加Ca~(2+)的螯合剂EGTA处理后,PLD活性与对照组相比表现出降低,表明低温胁迫下高山离子芥叶中Ca~(2+)参与内源性ROS对PLD活性的调控。     

4种改良CTAB法提取石榴成熟叶片DNA的比较研究

【目的】研究从成熟石榴叶片中提取高质量基因组DNA的方法。【方法】根据成熟石榴叶片组织中富含多酚、多糖的特点,以峄城中国石榴种质资源圃20种石榴成熟叶片为材料,分别采用改良CTAB法(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)4种方法提取成熟石榴基因组DNA,通过琼脂糖凝胶、紫外分光光度计分析、ISSR扩增等方法检测所提取DNA的质量。【结果】改良的CTAB Ⅳ法能从各个石榴品种的成熟叶片中提取出基因组DNA,琼脂糖电泳胶孔干净,无拖带,且DNA的纯度和完整性都较好,OD260 nm/OD280 nm的比值均在1.8~2.0之间,无降解现象,其质量、产量都高于其他改良CTAB法。经ISSR- PCR扩增结果表明,此方法提取的基因组总DNA完全适于ISSR分析。其主要的步骤是：在石榴叶片的研磨中添加Vc、PVP等抗氧化物质,加入CTAB提取液后65 ℃水浴30 min后冷却至室温,离心条件为15℃,10 000 r/min,10 min,DNA粗提液用氯仿抽提3次,可获得高质量的DNA。【结论】改良的CTAB Ⅳ法能有效地从石榴成熟叶片中提取到高质量的基因组DNA。     

奶牛精子RNA提取

优选3头公牛细管冻精,采用上游法获得纯化精子,以含体细胞污染的精子作对照,应用离心层析柱方法和Trizol一步法相结合提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的D260/280值和产量,并对总RNA进行RT-PCR和凝胶电泳。结果显示,纯化的牛精子中不含体细胞,奶牛细管精液总RNA在2 h内完成提取,D260/280值为1.80,大于200 bp的总RNA产量为0.92 μg/107个精子,精子总RNA进行RT-PCR,电泳后可得到清晰的SRY、LEP和RPS23基因3条带,不含18S rRNA基因条带。结果表明,离心层析柱法和Trizol一步法相结合可获得高质量的奶牛精子总RNA,且纯度和完整度高,可满足分子生物学研究的要求。     

五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

目的：研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性样品的相对提取效率,为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取,用荧光RT-PCR方法进行检测,获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值,分析五种提取方式的相对提取效率。结果对合适的提取样品,磁珠提取法相对提取效率最高,吸附柱法其次,Trizol提取法相对效率较差;在三种磁珠提取法中,提取效率相差在2个CP值内,差异不明显,但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定,效率最高;国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。     

从羊皮肤组织中提取总RNA方法的改进

在借鉴动物组织RNA提取方法的基础上,结合使用RNAlater保存液和Trizol试剂,改进了提取步骤和反应体系。利用改良的总RNA提取方法,从羊皮肤组织中快速、高效地提取了高质量总RNA,提取的总RNA可满足基于RNA分析技术的相关分子生物学试验需要。     

Genetic analysis of the G and P genes in ungulate respiratory syncytial viruses by RNase A mismatch cleavage method

The G and P genes of bovine, ovine and caprine respiratory syncytial (RS) viruses were analyzed by RNase A one-dimensional fingerprinting, using A51908 as the reference strain. Antisense G or P RNA probes of bovine RS virus strain A 51908 were hybridized to total RNA extracted from bovine turbinate cells infected with bovine, ovine or caprine RS virus strains. The RNA:RNA heteroduplexes were digested with RNase A and the resistant products were analyzed by gel electrophoresis. Comparative analysis of the cleavage patterns revealed heterogeneity among bovine, ovine and caprine RS virus isolates. Ovine RS virus strains generated RNA cleavage patterns more distantly related to the bovine or caprine RS virus strains, particularly in the G gene. Statistical analysis of the results obtained indicated that genetic differences between bovine and ovine viruses were larger, compared with the ones among bovine strains themselves. The same analysis also revealed a close genetic relation among bovine and caprine strains. These results are discussed in terms of ungulate RS virus genetic variation and vaccine development.     

牧草研究3种植物枯落物水提液对达乌里胡枝子幼苗生长的作用

通过研究黄土高原丘陵沟壑区3种主要草地植物（长芒草Stipa bungeana、达乌里胡枝子Lespedeza davurica、茵陈蒿Artemisia capillaris）枯落物水提液对达乌里胡枝子幼苗生长特性的影响,结果表明：不同质量分数处理下,3种植物水提液对达乌里胡枝子幼苗伸长和全株质量均有明显抑制作用,长芒草和茵陈蒿水提液在高质量分数时对达乌里胡枝子幼苗根质量有抑制作用,对根长影响不明显,达乌里胡枝子枯落物水提液仅在高质量分数下对其自身幼苗干质量和根长有显著影响。说明3种牧草的枯落物水提液对受体物种存在明显的抑制潜势,且对质量分数效应有敏感响应。     

本氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立及引物筛选

以CTAB法提取的本氏针茅(Stipa bungeana Trin.)基因组DNA为模板,采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对影响本氏针茅ISSR-PCR反应体系中的DNA、Taq酶、dNTPs、引物和Mg2+进行优化,旨在建立适合本氏针茅ISSR-PCR分析的最佳反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中各组分的浓度分别为:DNA(20ng/μL)2.5μL、Taq DNA酶(5U/μL)0.1μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL、引物(10μmol/L)2.3μL、Mg2+(25mmol/L)1.4μL、10×Buffer 2.5μL、ddH2O 9.6μL。经过体系验证和引物筛选试验表明该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立为本氏针茅种质资源遗传多样性研究提供了理论基础。     

球虫抗药性分子生物学检测技术的建立

选择在敏感虫株中沉默、抗药虫株中表达的特异序列AGD5设计检测引物，采用RT—PCR方法。以总RNA反转录的cDNA为模板，RT—PCR方法能够鉴别马杜霉素抗药虫株和3株马杜霉素敏感虫株（2株对所有药物敏感的不同地理株，1株地克珠利抗药性虫株对马杜霉素敏感），此鉴定结果与鸡体试验的结果一致，说明敏感虫株和抗药虫株在该序列上的差异发生在转录水平。而以卵囊总DNA为模板的PCR方法不能鉴别敏感和马杜霉素抗药性虫株。