猪精子和睾丸组织RNA的初步分析

试验采用Trizol一次法提取猪精子和睾丸组织的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中Protamine-1(PRM-1)、Protamine-2(PRM-2)、Clusterin、Heat shock protein 90(HSP90)、C-myc基因的mR-NA是否存在;通过不同精子数量的使用,检测在本试验条件下扩增出清晰PRM-1带所需要的适宜精子数量;通过琼脂糖电泳检测精子与睾丸组织RNA的电泳特征.结果,猪睾丸组织中有PRM-1、PRM-2、Clusterin、HSP90、C-myc的mRNA,而射出的猪精子(上游处理)本试验只检测出PRM-1的mRNA;在使用RNA沉淀剂时,3.0×107～6.5×107精子可得到清晰的PRM-1条带;本试验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖胶电泳图.初步研究的结果表明:射出猪精子中存在的RNA种类与睾丸组织中存在的RNA种类差异大;猪精子RNA的18S和28S片段与睾丸组织无明显差异.猪精子的RNA需要更多的研究.     

猪精子RNA提取及cDNA质量检测

为了有效分离猪精子RNA,试验通过精子上游法获得纯净精子样本,采用改良TRIzol法提取精子总RNA,经核酸测定仪及琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和质量,RT-PCR检测相应体细胞标记基因E-Cadherin、CD4和c-kit。结果表明:研究建立的精子RNA提取法可获得高质量的RNA,浓度约为203 ng/μL,OD260/280值为1.99,并且无其他体细胞标记基因扩增产物,可用于猪精子mRNA的研究。     

牦牛精子总RNA提取方法的研究

实验旨在制备并获得足够数量和高质量的牦牛精子总RNA,经3倍体积45%Percoll单层梯度液纯化牦牛精子后,采用试剂盒(RNeasy Kit)、热TRIzol和TRIzol一步法分别提取精子总RNA,使用超微量紫外分光光度计分析,并进行RT-PCR和凝胶电泳。结果表明:纯化的牦牛精子中体细胞基本去除;3种方法提取精子总RNA均无基因组DNA污染,可获得GAPDH基因条带(126 bp);与热TRIzol和TRIzol一步法相比,试剂盒提取的总RNA(OD260/280=1.89,浓度为0.33μg/107精子)质量更高(P0.05),且能扩增出完整的β-actin、SRY、RPS23基因3条带。结果显示,试剂盒能获得高质量的牦牛精子总RNA,其纯度和完整性高,为后续分子生物学研究奠定基础。     

荔枝果皮总RNA提取方法的筛选

以三月红荔枝果皮为试验材料，通过采用改良CTAB法、SDS法、改良SDS法、改良Bugos法和RNAplant plus Reagent试剂盒（TIANGEN公司）提取总RNA，采用浓度检测、纯度检测、RT-PCR等方法进行提取结果检测，进而筛选出最佳的提取方法。结果表明，这五种方法都能从三月红荔枝果皮中提取出总RNA，但总RNA浓度和纯度有明显的差异。其中采用改良Bugos法、改良SDS法和RNAplant plus Reagen试剂盒提取RNA的浓度较高；采用改良CTAB法和RNAplant plus Reagen试剂盒提取的总RNA纯度较高，完整性较好。采用SDS法、改良SDS法和改良Bugos法所提取的荔枝果皮总RNA纯度低，降解严重。经RT-PCR验证，采用改良CTAB法和RNAplant plus Reagen试剂盒均能扩增得到200bp的18sRNA编码基因片段。综合以上各项检测的结果，改良CTAB法为提取荔枝果皮总RNA的最佳方法，总RNA质量和得率满足后续分子生物学实验的需要。     

猪囊尾蚴总RNA的提取与mRNA的分离

目的为比较对猪囊尾蚴总RNA提取与mRNA分离方法的优点。方法采用Promega公司的SV总RNA分离体系、RNAgents总RNA分离体系和hioDev—Tech的TRIZOL LS试剂,对猪囊尾蚴总RNA进行了提取;用Promega的PolyA Ttract mRNA分离体系和Amersharn的Quickprep微量mRNA纯化试剂盒对mRNA进行分离。结果表明经改良的TRIZOLLS试剂,提取猪囊尾蚴RNA效果好,而PolyA Ttract mRNA分离体系分离的mRNA含量高,纯度好。结论所分离的mRNA适合于构建cDNA表达文库。     

柱花草总RNA提取方法比较

以热研2号柱花草（Stylosanthes guianensis Reyan No.2）叶片为材料,利用紫外分光光度计和凝胶电泳法比较SDS 酚抽提法、CTAB法、Trizol试剂盒和柱式植物RNAout试剂盒法提取柱花草总RNA的质量和纯度。结果表明,改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA的OD260 nm/OD280 nm分别是1.85和1.93,OD260 nm/OD230 nm均大于2.0。凝胶电泳结果表明,改良CTAB法及柱式植物RNAout试剂盒法均有28S rRNA和18S rRNA两条清晰的条带,且无降解。其他两种方法获得的RNA品质较差,有降解和弥散现象。将改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的RNA逆转录成cDNA,cDNA能扩增出一条清晰的β actin基因片段,进一步证明了改良CTAB法和柱式植物RNAout试剂盒法提取的总RNA具有很高的纯度,其中柱式植物RNAout试剂盒法的效果好于改良CTAB法。     

奶牛精子RNA提取

优选3头公牛细管冻精,采用上游法获得纯化精子,以含体细胞污染的精子作对照,应用离心层析柱方法和Trizol一步法相结合提取总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的D260/280值和产量,并对总RNA进行RT-PCR和凝胶电泳。结果显示,纯化的牛精子中不含体细胞,奶牛细管精液总RNA在2 h内完成提取,D260/280值为1.80,大于200 bp的总RNA产量为0.92 μg/107个精子,精子总RNA进行RT-PCR,电泳后可得到清晰的SRY、LEP和RPS23基因3条带,不含18S rRNA基因条带。结果表明,离心层析柱法和Trizol一步法相结合可获得高质量的奶牛精子总RNA,且纯度和完整度高,可满足分子生物学研究的要求。     

高山离子芥愈伤组织总RNA的提取方法研究

为了探寻提取高山离子芥（Chorispora bungeana）总RNA的最佳方法和条件。本研究分别采用改良的Trizol法、柱式离心法和CTAB法提取高山离子芥RNA,比较其得率、纯度、完整性和反转录后的PCR扩增效果;并对RNA的保存以及去RNA酶的处理进行了优化。结果表明,改良的Trizol法提取的RNA纯度和得率高、完整性好,转录后的PCR扩增效果好;RNA提取后室温保存8 h内降解较少,-80 ℃至少保存30 d。枪头、离心管等去RNA酶处理不完全会导致大量RNA降解,电泳槽等工具及电泳液的RNA酶灭活不彻底会使RNA在电泳过程中降解。     

骨组织中总RNA提取方法的改进

为了改进经典Trizol法,我们建立了一种有效提取矿化骨组织中总RNA的新方法。在Trizol裂解时加入等体积水饱和酚,在异丙醇沉淀时加入高浓度的盐溶液,并重复氯仿抽提1次。通过紫外分光光度法和1%甲醛变性凝胶电泳法分析提取RNA,以其逆转录cDNA为模板,经PCR扩增雌激素受体(ER)基因予以鉴定。结果,本方法获得的总RNA A260/A280达到1.85以上,电泳条带显示RNA完整,RT-PCR结果显示其纯度较好。结果表明,改良Trizol法是一种从矿化骨组织中提取总RNA的高效便捷的方法。     

猪各组织器官内肌生成抑制素基因mRNA表达谱的研究

用Trizol试剂法提取军牧一号猪的骨骼肌、心肌、肝、肾、肺、脾、胰、脂肪的总RNA做RT-PCR和嵌套PCR,结果在军牧一号猪骨骼肌、心肌和脂肪组织内检测到了肌生成抑制素mRNA的表达,而在其他组织中未检测到.     

小鼠睾丸组织中转录因子Ets1、Ets2 cDNA的克隆与测序

为了研究转录因子Ets1、Ets2在睾丸组织中有无表达,试验采用Trizol法提取了正常小鼠睾丸组织的总RNA,RT-PCR反应后进行序列测定。结果表明:转录因子Ets1、Ets2在正常小鼠睾丸组织中均有表达。     

五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

目的：研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性样品的相对提取效率,为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取,用荧光RT-PCR方法进行检测,获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值,分析五种提取方式的相对提取效率。结果对合适的提取样品,磁珠提取法相对提取效率最高,吸附柱法其次,Trizol提取法相对效率较差;在三种磁珠提取法中,提取效率相差在2个CP值内,差异不明显,但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定,效率最高;国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。     

改良TRIzol法高效提取东北林蛙皮肤总RNA

目的:建立一种从两栖动物皮肤组织中提取高质量总RNA的方法。方法:改良传统TRIzol法,提取皮肤总RNA,紫外分光光度计测定RNA纯度和得率,1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。结果:改良方法提取的总RNA,其A260/A280值在1.8～2.1之间,A260/A230大于2;琼脂糖凝胶电泳显示清晰的28s rRNA和18s rRNA条带,且28s rRNA条带亮度约为18s rRNA的2倍。结论:改良TRIzol法提取的总RNA纯度高、完整性好、杂质少、得率大,易于操作掌握,可以用于相应的分子生物学试验。     

从羊皮肤组织中提取总RNA方法的改进

在借鉴动物组织RNA提取方法的基础上,结合使用RNAlater保存液和Trizol试剂,改进了提取步骤和反应体系。利用改良的总RNA提取方法,从羊皮肤组织中快速、高效地提取了高质量总RNA,提取的总RNA可满足基于RNA分析技术的相关分子生物学试验需要。