带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础.     

猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)UL区基因序列(KJ789182)设计2对特异性引物,扩增PRV NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,然后绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUC-TKLRE。用转移质粒pUC-TKLRE和PRV双基因缺失突变株rPRV NY-gE~-/gI~- DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--EGFP~+。经PCR鉴定及测序,证实获得的三基因缺失株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--EGFP~+在TK基因上缺失了311 bp。该病毒与亲本株PRV NY在ST细胞上培养时,具有相似的生长曲线,但其体外生长动力学比亲本株弱;且对非靶标动物小鼠是安全的。结果表明,本试验釆用同源重组,同时结合蚀斑克隆纯化技术,成功构建了1株以目前PRV流行变异株为亲本株的gE/gI/TK三基因缺失病毒,为防控当前PRV变异毒株的疫情、根除PR提供技术支持。     

伪狂犬病病毒Bartha株gC膜外区部分基因的原核表达及纯化

构建伪狂犬病病毒(PRV)gC膜外区部分基因的重组质粒,原核表达并纯化目的蛋白.根据GenBank已发表的伪狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641),设计并合成了1对引物,以PRV Ba株为模板,PCR扩增出PRV gC膜外区部分基因片段;将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得大小为35 ku的重组蛋白,命名为pET-gCN813.按照His-Bind纯化试剂盒说明书纯化表达产物,获得融合蛋白的纯化产物.     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。     

伪狂犬病病毒Bartha株TK-/LacZ+突变株的构建及其生物学特性研究

本研究将伪狂犬病病毒Bartha株基因组与含有LacZ标志基因的TK基因转移质料pUEKPZ共转染猪肾传代细胞PK－5，细胞出现病变后，反复冻融3次收毒，按1：5稀释接种于IBRS－2细胞。在X－gal存在下挑取蓝斑，蓝斑筛选3次，再进行空斑试验，同时用PCR扩增LacZ基因，经3次空斑纯化，随机挑取的空斑均能扩增出LacZ基因，证实所获得的重组病毒为伪狂犬病病毒Bartha株TK^-/LacZ^ 突变株。TCID50试验表明，TK失活对Bartha株在细胞上增殖无影响；Balb/C小鼠试验表明，该突变对Balb/C小鼠的安全性明显高于Bartha亲本毒株。     

猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK~-的构建及其生物学特性

为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研...     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.     

重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化

参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。     

基于US区缺失位点猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别诊断方法的建立

依据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒全基因组序列,针对gI、gE、28K、TK四个基因序列,设计、合成了5条引物,并对野毒株SA株、gI-/gE-/PRVSA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增,得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带,其中BarthaK61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒株和两种疫苗株的鉴别诊断方法。