红麻 SRAP -PCR 反应体系优化及多态性引物的筛选

采用正交试验L16（43）设计,以dNTP、引物和Taq DNA聚合酶3种因素4个水平,并设置了8个模板DNA浓度梯度。扩增效果表明,红麻的SRAP-PCR最佳反应体系为2μL 10＆#215;Taq Reaction Buffer、20 ng模板DNA、 dNTP 220μmol/L、引物0.35μmol/L、 Taq DNA聚合酶0.5 U,总体积为20μL。同时对256对SRAP引物进行扩增,筛选出条带清晰、多态性较好的引物100对。该反应体系及100对多态性引物组合应用于今后红麻的遗传多样性、品种鉴定、亲缘关系、遗传图谱构建、 QTL定位等研究。     

茶树SRAP反应体系优化及引物筛选

以茶树叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg2+、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、模板DNA 5种因素5个水平,对茶树SRAP反应体系进行了研究,建立了茶树SRAP最佳反应体系。结果表明,茶树SRAP最佳反应体系为:Mg+22.0mmol/L、引物各0.5μmol/L、dNTP 0.1mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5U/μL、模板DNA 4ng/μL,总体积为10μL。运用该体系,从128个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的56个引物组合。这一体系的建立及引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行茶树分子遗传学研究提供了理论依据。     

甜菜SRAP-PCR反应体系的优化

为了建立适宜甜菜的SRAP反应体系,以40个不同类型的甜菜品系为试验材料,研究了PCR反应体系的主要成分对SRAP扩增结果的影响。对SRAP反应体系中的DNA模板浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度以及dNTP浓度进行了探索,确立了适合甜菜的SRAP反应体系为:在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Taq DNA聚合酶1.0U,引物60ng,dNTP(2.5mmol/L)为1.6μL,扩增程序为94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃1min,35℃1min,72℃1min的条件下运行;随后的35个循环复性温度提高到50℃,最后72℃延伸10min。并利用该反应体系对甜菜40个不同品系进行SRAP反应,用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品系间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠,可以用于甜菜的分子标记研究。     

柱花草DNA提取及ISSR反应体系的正交优化

报道了以新鲜嫩叶提取高纯度、完整性好的柱花草基因组DNA方法.并利用正交设计,从Taq聚合酶、Mg2 、dNTP、DNA模板、引物浓度5个因素、4个水平对柱花草ISSR反应体系进行优化试验,确立了适合柱花草的快速而又高效的ISSR反应体系,即20 μL反应体系中含1×PCR缓冲液,2.0 mmol/L Mg2 ,0.2 mmol/LdNTP,0.4 μmol/L引物,60 ng DNA模板,1 U Taq聚合酶.     

芒果ISSR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对芒果ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化试验,通过不同反应体系扩增效果比较,建立优化的芒果ISSR反应体系,即25μL的PCR体系中含有DNA模板25 ng、Mg2+浓度为1.5 mmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L、引物0.32μmol/L、Taq DNA聚合酶1.25 U。这为进一步运用ISSR标记在DNA分子水平上对芒果种质资源进行分析奠定基础。     

菰SRAP-PCR反应体系的优化与建立

利用单因素分析法对影响菰SRAP-PCR扩增效果的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板和引物浓度5种因素进行了优化。结果表明:建立了适合菰基因组的SRAP-PCR的体系:1μL 10×Buffer、0.5 U Taq DNA聚合酶、2 mmol/L MgCl2、50 ng模板DNA、0.20 mmol/L dNTPs、正反向引物的浓度各为0.7μmol/L,共10μL。选取5对引物,利用该体系对72份菰样本进行PCR扩增,共获得132条清晰的谱带,其中91条具有多态性,比率为68.9%。菰SRAP-PCR反应体系的优化和建立将为利用该标记进行种质遗传多样性分析和连锁图谱构建等研究提供技术支持。     

茶树ISSR-PCR反应体系的建立

通过优化影响茶树 ISSR-PCR 的主要参数,确立了适用于茶树的 ISSR 反应体系和扩增条件。结果表明在 20 μl 反应体系中,模板 DNA、引物、Mg++、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶五种主要成分的最适浓度分别为 10ng、150 nmol/L、1.5 mmol/L、150 μmol/L、0.5 U。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其 Tm 值平均高 4.5℃,扩增出足量产物至少需要 30 个热循环。利用该优化反应体系和扩增条件,对 13 份不同茶树种质资源进行ISSR-PCR 扩增,扩增产物的多态性为 77.6%。引物 TRI18 构建的 ISSR 指纹图谱,可以区分 13 份茶树资源中的 12 份,分辨率达 92.3%。     

沉香属植物基因组DNA提取及SSR反应体系的优化

以白木香为材料,研究沉香属植物基因组DNA提取方法,并优化SSR-PCR反应体系。通过改良CTAB法提取白木香叶片基因组DNA,经电泳和吸光度检测。优化影响白木香SSR-PCR主要参数,确立适合沉香属植物的SSR-PCR反应体系和扩增条件：在20 μL反应体系中,模板DNA、引物、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶等5种主要成分的最适浓度分别为2.5 ng/μL、1 μmol/L、2 mmol/L、0.2 mmol/L、1.2 U;并用9份沉香属植物DNA样品对SSR-PCR反应体系验证,能扩增清晰     

马铃薯SSR-PCR体系的优化与建立

以马铃薯叶片DNA为模板,采用单因素试验的方法,对影响马铃薯SSR-PCR反应体系的主要成分模板DNA、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度及退火温度进行了优化,并建立最优化的马铃薯SSR扩增反应体系。结果表明:在20μL反应体系中,模板DNA用量为60 ng,dNTP为0.3125 mmol/L,引物浓度为2.4pmol,Mg2+为1.5 mmol/L,Taq酶为0.5 U,筛选各引物最适宜的退火温度,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增条带清晰,优化后的SSR反应体系稳定性好,可用于马铃薯遗传多样性分析。     

国兰杂交品种(系)SRAP-PCR反应体系优化及引物快速筛选

以国兰杂交品种(系)为材料,采用L16(45)正交试验设计对Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板及引物等5个重要影响因素进行优化,确定国兰杂交品种(系)SRAP-PCR反应的最优反应体系为(25μL体系):Taq DNA聚合酶,1 U;Mg2+,1.8 mmol/L;dNTPs,0.08 mmol/L;模板DNA,100 ng;引物,上下游各0.3 mmol/L;10×PCR Buffer,2.5μL。此外,本试验采用DNA混合池技术(DNA pooling)快速筛选SRAP引物,从180对SRAP引物组合中筛选出39对扩增产物丰富、多态性高的引物组合。与常规方法相比,该技术明显缩短试验周期、节约了模板用量,为快速高效筛选SRAP引物提供了新思路。     

狗牙根ISSR-PCR反应体系的优化

利用正交设计试验,对影响ISSR-PCR的Mg~(2+)、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA 5个因素进行优化试验.结果表明:25μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳条件为Mg~(2+)2.5 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA 40 ng.通过对狗牙根ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到引物UBC881的最佳退火温度为50.5℃.该体系在24个狗牙根种质中获得较好的扩增结果,该优化体系为今后利用ISSR技术进行狗牙根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础.     

甜菜SSR-PCR反应体系的优化

为了建立适宜甜菜的SSR反应体系,笔者以甜菜不育系TB005A为试验材料,研究了甜菜SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的DNA模板浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度、dNTPs浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合甜菜的SSR反应体系为;在20μL反应体系中,模板DNA为60ng,引物（50ng／μL）1．2μL,Taq DNA聚合酶1．0U,dNTPs（2、5mM／L）0．6μL。并利用该反应体系对30个甜菜不同品系进行SSR反应,用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品系间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

甜菜ISSR-PCR反应体系的优化

以甜菜基因组DNA为模板,研究了ISSR的主要影响因素,建立一套适宜于甜菜的ISSR优化反应体系及程序,并对该优化体系进行了验证.实验结果表明:①优化的ISSR扩增的反应体系为:20μL的反应体积中包括2.5mmol/L MgCl2,0.25mmol/L dNTPs,1.5U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,10×PCR Buffer 2μL,100ng DNA模板.②优化的PCR扩增条件为:94℃预变性3min,然后94℃变性30s,45℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环后,72℃延伸5min.③利用优化的反应体系仅用1条引物就能将10份甜菜材料区分开.     

正交优化芒果SRAP扩增体系及引物筛选

利用正交实验设计,对芒果SRAP-PCR反应的5因素(Mg2+、dNTPs、模板DNA、引物和Taq DNA聚合酶)4水平的扩增效果进行研究,确立适合芒果SRAP-PCR反应的最佳体系。总体积25μL的SRAP-PCR优化的最佳反应体系中含有:2.5μL 10×buffer、20 ng模板DNA、2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、0.4μmo1/L Primer、Taq DNA聚合酶1.5 U。并运用该体系从153对引物组合中初步筛选出50对SRAP引物组合。建立的SRAP标记可为芒果遗传多样性、分子标记及辅助育种等提供研究基础。     

咖啡ISSR与RAPD-PCR反应体系优化

以中粒种咖啡部分种质为试材,采用U25（55）均匀设计表,对影响ISSR和RAPD标记的模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶和引物浓度5个因素进行优化,分别建立适合于中粒种咖啡ISSR-PCR和RAPD-PCR标记的反应体系。结果表明：2种标记的反应体系相似,20 μL的反应体系中含DNA模板20 ng,Mg2+ 1.5 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,Taq酶1.25 U,引物0.6 μmol/L。利用所确立的体系对13份中粒种咖啡种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好     

芒果SSR-PCR反应体系的优化

通过正交实验,以芒果品种金煌芒为材料,对影响芒果SSR-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq酶、模板DNA、引物这5个因素进行了优化。结果表明,各因素水平变化对PCR反应影响的显著性依次为:模板DNAdNTPs引物Mg2+Taq酶。最终确立SSR反应体系的最优条件为:20μL体系中,10×buffer2μL,模板DNA80ng,dNTPs0.4mmol/L,引物0.2μmol/L,Mg2+1.8mmol/L,Taq酶0.75U。     

甘蔗cDNA-SCoT差异显示分析PCR反应体系建立、优化及应用

cDNA-SCoT差异显示分析是应用于植物基因差异表达研究的一项新技术.本研究以甘蔗品种桂糖11号根尖为材料,提取总RNA并反转录第1链cDNA,对影响甘蔗cDNA-SCoT差异显示PCR反应的cDNA模板、SCoT引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+等因子进行优化,建立甘蔗cDNA-SCoT反应体系,同时应用优化后反应体系分离25％PEG6000胁迫诱导甘蔗根尖差异表达基因片段.结果表明:各项因子均对PCR扩增效果存在影响,20μL反应体系中各因子的最佳含量如下:cDNA 80 ng、引物浓度1.0 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs浓度200 μmo1/L、Mg2+浓度1.8 mmol/L.研究结果还显示,SCoT引物扩增多态性丰富,平均每条引物扩增条带30条,多态性条带比率为46.9％,6条引物分离得到PEG诱导甘蔗根尖特异表达片段45条,表明本研究所建立的甘蔗cDNA-SCoT反应体系具有操作简便、结果稳定、重复性好、成本低、多态性丰富等优点,可为甘蔗基因差异表达研究提供新的技术支持.     

胡椒ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子、双因子实验研究了胡椒ISSR-PCR反应体系中热参数和5个主要成分,即退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间以及Mg2+、dNTPS、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶对扩增结果的影响,建立了适合胡椒ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25 μL反应体系中,内含2 mmol/L Mg2+、200 μmol/L dNTPS、1×PCR Buffer、2 μmol/L引物、100 ng模板、1 U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性3 min, 94℃变性120 s,复性60 s,72℃延伸 3 min,循环35个,结束后72℃延伸7 min。这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行胡椒种质鉴定、遗传多样性分析奠定了基础。     

利用正交设计优化甘蔗SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对甘蔗SRAP-PCR反应体系的五大因素(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶)在4个水平上进行优化,得到如下结论:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次是:Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA;通过对各因素进行筛选,建立甘蔗SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为:dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.1μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶0.25U和模板DNA 60 ng。     

新型植物油莎豆DNA提取与SRAP体系优化

以14个不同地理来源的油莎豆品系为实验材料,研究了油莎豆DNA快速提取方法;以SRAP反应体系中DNA模板量、Mg2+浓度和引物浓度3个因子分别设置3个水平,共配制27个反应体系,对油莎豆SRAP反应体系进行优化。研究结果表明:改良CTAB法可获得较高质量的DNA,参试材料的A260/A280介于1.70～1.98;在27个SRAP反应体系(15μL)中,最优反应体系为DNA模板25ng、Mg2+1.5mmol/L、引物浓度1μmol/L、dNTPs 0.3mmol/L和Taq酶1U,可扩增出清晰稳定的多态性条带。