生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

鲤鱼重组IL–17N的原核表达条件优化及蛋白纯化

为获得可溶的鲤鱼IL–17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N,确定IL–17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL–17N原核重组表达载体GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N;融合标签MBP、SUMO–GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO–GST–17N、MBP–17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP–17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8～12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP–17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP–17N蛋白。     

烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

    为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein, Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3 h后,使用终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4 h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66 kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.     

cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达

[目的]对cry基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据NCBI数据库信息设计引物序列,采用PCR技术从抗虫棉基因组DNA中扩增出抗虫基因cry的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,利用pGEX原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因cry的两段保守序列,长度分别为304和853 bp;SDS-PAGE检测结果显示,经IPTG诱导后重组质粒pGEX-4t-1-304和pGEX-4t-1-853成功地表达了大量GST融合蛋白,分子量分别为39和62.4 kDa,与预期结果一致;确定了IPTG最佳诱导浓度为0.15 mmol/L,最佳诱导时间为7h。[结论]为今后检测转Bt基因农作物奠定了基础。     

cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达(英文)

[目的]对 cry 基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据 NCBI 数据库信息设计引物序列,采用PCR 技术从抗虫棉基因组 DNA 中扩增出抗虫基因 cry 的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株中,利用 pGEX 原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同 IPTG 浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因 cry 的两段保守序列,长度分别为304 和 853 bp;SDSPAGE 检测结果显示,经 IPTG 诱导后重组质粒 pGEX4t1304 和 pGEX4t1853 成功地表达了大量 GST 融合蛋白,分子量分别为39 和 62.4 kDa,与预期结果一致;确定了 IPTG 最佳诱导浓度为 0.15 mmol/L,最佳诱导时间为 7 h。[结论]为今后检测转 Bt 基因农作物奠定了基础。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中稳定表达条件的优化及纯化

将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。     

红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。     

水稻可溶性OsVDAC5蛋白的外源表达及鉴定

通过生物信息学分析确定水稻(Oryza sativa L.)Os VDAC5的可溶性肽段,将相应的编码区克隆于p GEX-4T-1原核表达载体中,进行IPTG诱导表达和GST亲和层析纯化,利用SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白。结果表明,成功构建的p GEX-4T-1-Os VDAC5(1-75aa)原核表达载体,经过体外IPTG诱导,在35 k Da处可检测到可溶性目的蛋白,并获得外源蛋白表达的最适温度为15℃和最佳诱导时间为8 h;经过GST亲和层析,SDS-PAGE可检测到较为单一的蛋白条带,得到纯化的GST-Os VDAC5(1-75aa)融合蛋白。     

新型免疫分子TRIM23参与斑马鱼 抗嗜水气单胞菌免疫应答

为获得纯化的斑马鱼TRIM23(tripartite motif 23)重组蛋白并研究其免疫功能,试验采用逆转录PCR(RT-PCR)技术扩增TRIM23全长序列,将其与原核表达载体pGEX-4T-1连接并转化至E.coli Rosetta感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用谷胱甘肽巯基转移酶(GST)蛋白纯化介质纯化目的蛋白后,将其与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)孵育,检测抑菌活性。结果显示,重组表达载体pGEX-TRIM23在宿主菌Rosetta中表达出约91 ku的重组蛋白,且蛋白部分以可溶形式存在于上清中,经体外抑菌试验检测发现,TRIM23蛋白能够抑制嗜水气单胞菌的增殖。基于以上研究,推测TRIM23在斑马鱼抗细菌免疫应答过程中发挥作用。     

核蛋白Sam68的原核表达及鉴定

为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体,表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白,采用PCR扩增Sam68基因,插入pGEX-4T-1的Eco R I和Sal I位点,并转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达,GST pull-down技术验证Sam68的结合活性。酶切和测序结果证实Sam68基因正确插入pGEX-4T-1载体中,载体能够在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,且纯化的GST-Sam68蛋白具有与PI3K p85特异结合的活性,说明成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。     

七子花叶片蛋白组分含量动态分析

对七子花叶片中5种蛋白组分含量的动态变化进行了研究。结果表明七子花叶片的总蛋白含量变化曲线呈“W”型,叶片生长初期含量基本保持稳定,5月中旬含量开始下降,并且下降幅度较大,6月中旬达一低值后,其含量迅速上升,到7月中旬（盛花期）达一峰值,接着其含量下降,到8月中旬达到最低,后又上升直至落叶时达到最高值。水溶蛋白含量季节性变化呈“低-高-低-高”,在叶生长初期上升,峰值出现在5月中旬,以后逐渐下降,到7月中旬达最低值,之后缓慢上升,落叶前达到最高值。盐溶蛋白在叶生长初期迅速下降,到5月中旬达最低值,后一直呈上升趋势。醇溶蛋白与碱溶蛋白在叶生长初期有所下降,至6月中旬达到最小值,以后迅速上升,至7月中旬达到高峰后大幅度下降,在落叶前又有所回升。杂蛋白在叶生长初期迅速下降,至5月中旬达到最低值后,基本趋于稳定。推测水溶蛋白、盐溶蛋白和醇溶蛋白、碱溶蛋白与七子花的展叶和开花生理过程有密切关系。西北林学院学报22卷第6期杨蓓芬等七子花叶片蛋白组分含量动态分析     

动物体蛋白合成与降解规律研究进展

动物的生长发育速度实质反映了体蛋白沉积量的变化。体蛋白沉积量主要受蛋白质合成和蛋白质分解两方面的共同影响 ,蛋白质合成除受到基因调控制约外 ,还受到饲料及营养因素诸如锌、铬、脂肪酸及生长激素水平等的影响。蛋白质的降解与日粮组成、采食量、饲喂次数及神经系统和胃肠产生的生产抑素有关。文章通过对体蛋白合成与降解规律及饲料营养成分对体蛋白的合成及降解影响的探索 ,提出了提高蛋白质饲料利用率 ,使动物生产实现最大化的应用前景     

玉米蛋白组分的研究进展

从不同角度对谷物蛋白质进行分类,并阐述其特性;分别论述玉米四种蛋白组分的国内外研究进展,以期全面反映玉米蛋白组分领域的研究概况.     

烟草蛋白研究进展

从烟草中提取烟草蛋白,是解决目前动物蛋白紧缺问题的有效途径之一。介绍了烟草蛋白的组成与特性,分析了烟叶作为蛋白来源的潜力,综述了国内外烟草蛋白分离纯化技术的研究进展,讨论了影响烟草蛋白制备的主要因素,并对烟草蛋白的开发利用进行了展望。     

HLA-G1的基因表达、纯化及其活性分析

在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。     

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

内质网分子伴侣GRP94对伪狂犬病毒增殖的调节作用

为探究葡萄糖调节蛋白94(GRP94)对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)增殖的影响,以及GRP94与PRV结构蛋白之间的相互作用。利用慢病毒转染构建GRP94基因过表达的BHK-21细胞,以及CRISPR/Cas9技术构建GRP94基因敲除的BHK-21细胞,检测PRV感染不同细胞的增殖水平,比较内质网应激相关蛋白表达水平,探索GRP94与PRV结构蛋白之间的互作关系。结果表明,GRP94基因过表达细胞株显著有利于PRV增殖,而GRP94基因缺失细胞株对PRV增殖无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示,在GRP94基因缺失细胞株中,GRP78表达水平显著上调。免疫共沉淀结果表明,GRP94与gB、gD、gL具有相互作用。GRP94基因过表达有利于PRV增殖,检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)相关蛋白,研究GRP94在病毒增殖过程中的具体作用,可为PRV与内质网应激提供分子方面的研究基础,于对抗PRV病毒的感染具有重要意义。     

Expression and Purification of Recombinant MP-GFP Protein in Escherichia coli

Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant.     

猪圆环病毒分子生物学研究进展

猪圆环病毒是单链环状DNA病毒,其基因组中包含多个阅读框,其中2个主要的阅读框分别编码复制起始蛋白Rep和Rep'以及病毒衣壳蛋白:Rep和Rep'结合由PCV1的部分复制起点组成的双链DNA片段,但这2种蛋白的结合位点有细微差别;Rep蛋白不能单独启动病毒的复制,只有和Rep'蛋白一起才能启动PCV病毒的复制;PCV1感染PK15细胞后,用实时PCR检测rep和rep'转录子的数量,发现这2种转录子的比率随着时间的推移而不断发生变化;病毒衣壳蛋白基因是PCV基因间唯一变化很大的基因,其编码衣壳蛋白是PCV主要的免疫原性蛋白,其氨基端41个氨基酸与PCV2在细胞核内的定位有关.