犬新孢子虫NcSRS2基因真核表达质粒的构建

根据犬新孢子虫NcSRS2基因序列，设计了1对含有Kozak序列、PstⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物，以含有NcSRS2基因的质粒P43为模板，经PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段，用PstⅠ和XbaⅠ双酶切该片段，回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSR2 ORF基因，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，获得重组质粒pcNCSRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较，证实了重组质粒的正确性。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN—α基因序列设计了1对引物，应用PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约500bp的基因片段；将该片段克隆到pMD 18-T载体，经PCR、酶切及序列测定，该克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI GenBank上登录的2个猪IFN—α基因序列(登录号为M28623和X57191)比较，核苷酸的同源性分别为99．4％和99．2％。     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

堆形艾美球虫广东株Ea1A基因的扩增与序列测定

根据GenBank上登录的堆形艾关球虫Ea1A基因序列，设计了1对引物，以抽提的广东株的总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了Ea1A基因部分片段，并将此片段克隆至pGEM—T载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。     

猪CuZnSOD基因片段的克隆及不同生长阶段猪肝脏CuZnSOD基因表达的差异

从体质量1、20、40、60、90kg左右的杜长大猪的肝脏组织中提取基因组RNA，RT—PCR扩增CuZnSOD基因，获得了1务255bp的片段，以pGEM—TEasyVector为载体，将该片段克隆到大肠杆菌（E．coli）中，筛选阳性克隆测定其序列，分析表明该片段与报道的猪CuZnSODcDNA部分序列同源性达到100％，编码85个氨基酸组成的多肽，是成熟肽的一部分。以CuZnSOD基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT—PCR法，以18SrRNA为内标，研究不同生长阶段猪肝脏组织中CuZnSOD基因mRNA表达的差异。结果显示，1kg左右猪肝脏组织中CuZn—SODmRNA表达水平较高，体质量1～20kg猪的肝脏组织中CuZnSOD基因表达量呈下降趋势，体质量40kg的猪又显著上升，到生长后期即体质量90kg左右，CuZnSOD基因表达量又急剧下降。     

梅山猪β干扰素基因的克隆、原核表达及生物活性

利用PCR技术从中国梅山猪白细胞总DNA中扩增出猪β干扰素基因(MS-IFNβ)。将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，β干扰素基因全长561bp，编码186个氨基酸，与GenBank中S41178的序列同源性达99％，在128、177位核苷酸处发生了点变异，由G变为A，T变为C，但仅导致43位氨基酸由G变为E。在此基础上，合成了1对引物，通过PCR方法将编码成熟蛋白基因亚克隆到pGEX-KG表达载体，转化宿主菌BL2，(DE1)，经IPTG诱导后，得到高效表达，所表达蛋白质的大小约为47000，占总蛋白的23%。表达产物主要为不溶性的包涵体，包涵体经提纯后，能够抑制口蹄疲病毒(FMDV)增殖。     

猪大肠杆菌水肿毒素SLT-IIeA基因的克隆和序列分析

研究以本地猪水肿病大肠杆分离物ED1株为材料 ,利用 PCR克隆了含猪水肿病大肠杆菌 (VTEC) slt-IIe A基因 987bp的片段 ,并测定了含该克隆片段的 Bam HI、Hind 酶切片段的核苷酸序列。结果表明 ,slt-IIe A基因的编码区全长 960 bp,编码 3 1 9个氨基酸的蛋白质 ,序列与国外报导的 S1 1 79株进行比较发现其核苷酸同源性为 98.9%。经推导的氨基酸序列的同源性为 99.7%。这为进一步研究 slt-IIe A的生物学特性、水肿病的分子诊断及其防制打下基础     

羊MyoG基因内含子的扩增

以羊MyoG基因的内含子为研究对象,参考羊和猪MyoG基因的mRNA序列信息,选取保守基因序列设计上下游引物,采用PCR方法扩增羊MyoG基因内含子1和内含子2,克隆后进行序列测定.序列分析比较发现内含子1的片段与猪的同源性为71.9%,与人的同源性为65.7%;内含子2的片段与猪的同源性为77.9%,与人的同源性为62.7%.说明该基因的内含子在不同物种间具有较高的同源性.     

RT-PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的研究

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的基因组核苷酸序列，在S基因（纤突蛋白基因）5′端保守区设计了一对引物P3／P4，该对引物在TGEV扩增跨幅约为2.4kb；而PRCV由于在此区域存在一约0.6kb碱基缺失，扩增跨幅约为1.8kb。用引物P3／P4对TGEV Miller株、Purdue株和PRCV AR310株分别进行RT－PCR，根据RT－PCR扩增片段大小可以直接区分TGEV和PRCV。用引物P3／P4与引物P1／P2作Nested-PCR,提高了该RT－PCR的特异性和敏感性，建立的RT－PCR可为临床上诊断TGEV及调查我国是否存在PRCV感染提供可靠的鉴别手段。