鷄新城疫病毒的研究 (二)鸡新城疫病毒組織培养的初步观察

作者用前人方法,初步观察到三株鸡新城疫病毒能在鸡胚組織和Hela株細胞中繁殖并引起細胞变性。培养72小时的鸡胚組织培养液中出現較低的HA抗元性,Hela細胞核质部分HA滴度較高,原生质部分次之,培养液中則无HA性。試用去鸡胚胎蛋壳培养法繁殖鸡新城疫病毒弱毒株,測其HA滴度和毒力,似可相当于鸡胚接种培养。由于試驗数据尚少,有待进一步試驗,肯定其实用价值。     

高通量核酸液相芯片检测法对H5、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒的检测

为建立禽流感病毒和新城疫病毒的液相芯片快速检测方法,试验设计并合成针对H5、H9亚型禽流感病毒HA基因以及新城疫病毒NP基因的特异性引物、探针及探针反向序列,并将下游引物和探针反向序列进行生物素标记。将探针与不同编号的荧光编码微球偶联。通过将探针-荧光编码微球偶联物与HA、NP基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪检测荧光信号建立禽流感和新城疫快速液相芯片检测方法。结果显示,该法具有较高的特异性和灵敏度,非特异性反应很小,无明显交叉反应,该液相芯片快速高通量检测方法可同时检测新城疫病毒、H9亚型和H5亚型禽流感病毒,三株病毒毒株抗原的检测灵敏度分别为10~(-4)、10~(-5)和10~(-5)。同时,检测结果显示:三个毒株同步检测与单个毒株分别检测在检测的灵敏上度基本相当。研究建立的可以同时检测新城疫病毒、H9亚型和H5亚型禽流感病毒的快速高通量液相芯片方法,为该类病毒的检测提供了一种新工具,同时也为其他类似病毒的检测提供了借鉴。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

[目的] 纯化猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV）SVV-CH-HB2016毒株，并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。[方法] 以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验（IFA）结合间接ELISA筛选阳性细胞株，制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性，并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响，最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。[结果] 在蔗糖密度梯度为5%~45%（W/V）时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白，免疫小鼠血清抗体效价均达到了1：12 800，成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应，17株单克隆抗体能与病毒发生IFA作用；2G6、4A3和4C11 3株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用，也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附。经分析发现，除1F5与2E1、4B8与4F11外，其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位。[结论] 本研究初步建立了SVV的纯化方法，制备了17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体，为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础。     

建立快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株RT-PCR方法的研究

为了快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,试验通过建立的RT-PCR方法获得电泳条带大小不同的PCR产物,以此区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,并用RT-PCR方法检测实验室保存的12份临床阳性样品。结果表明:可以通过RT-PCR方法区分经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株,并且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等猪常见病毒无交叉反应;临床样品检测试验显示,1份为经典毒株、5份为高致病性毒株、5份为天津疫苗株,与测序结果相符。说明试验成功建立了同时区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株的RT-PCR方法,且特异性强、灵敏度较高、重复性好、操作简单。     

马立克氏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以马立克氏病毒814株(MDV-814)作为免疫用抗原,建立了2个MDV特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株—4A6、3D7。鉴定结果表明;两株细胞所分泌的McAb均为IgM类免疫球蛋白,具有MDVⅠ型病毒特异性,无中和反应特性和沉淀反应特性。利用两种McAb对国内标准强毒MDV-京1株进行鉴定,肯定其为MDV-Ⅰ型毒株。     

马立克氏病病毒单克隆抗体研究 Ⅰ.马立克氏病病毒和火鸡疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

采用马立克氏病病毒(MDV)和火鸡疱疹病毒(HVT)感染细胞匀浆抗原免疫 BALB/C 小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术获得了13件分泌 MDV 特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。其中9株 McAb 对三个血清型毒株均呈阳性反应;BC_3对血清Ⅰ、Ⅲ型毒株反应阳性:CE_(11)和 CB_3对血清Ⅰ型毒株呈阳性反应;EE_(12)对血清Ⅲ型发生反应.13株 McAb 既具有 ELISA 特性(最高效价1:100000),     

禽类呼肠孤病毒的分子生物学

1病毒特性 禽类呼肠孤病毒(ARV)为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的成员,与哺乳类呼肠孤病毒相比较,一方面具有共同的理化特性和形态特征:病毒粒子呈二十面体、无囊膜、直径约为60～80 nm.病毒基因组由10个基因节段组成的dsRNA,其核酸由双层蛋白质衣壳所包裹;另一方面自身还具有独特的生物学特性:(1)无血凝活性,能诱导细胞融合和多数毒株对自然宿主具有致病性.(2)血清学方法证实禽类呼肠孤病毒各毒株之间具有共同的群特异性抗原(与哺乳类RoeV无交叉抗原),但由于存在大量的交叉反应,有些群不能作为独立的血清型,故禽类呼肠孤病毒只能以抗原亚型存在.(3)通过对禽类呼肠孤病毒各代表株进行SDS-PAGE核酸电泳分析,禽类呼肠孤病毒的核酸电泳图谱明显有别于哺乳类呼肠孤病毒株,即使在禽类呼肠孤病毒株之间也存在明显的多态性,但目前尚未发现这种差异与血清型及致病性相关.     

禽流感病毒单克隆抗体的研制

用低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株全病毒作为抗原,制备能够用于建立ELISA检测AIV的特异性单抗;以间接ELISA和HI试验筛选出阳性克隆,并经有限稀释法三次亚克隆之后,共获得三株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在Dot-ELISA试验中三株单抗中的两株与13个AIV H9N2国内分离株、4个AIV H5N1国内分离株都反应,而与10个NDV国内分离株,IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.一株与13个AIV H9N2国内分离株反应,与4个AIV H5N1分离株、NDV、IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.     

犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

为建立一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP),本研究通过比对野毒株与疫苗株H基因设计特异性引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP和反应温度等条件分别进行优化,建立用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株的RT-LAMP。建立的RT-LAMP方法检测CDV野毒株时,在65℃水浴锅中反应40 min即可完成。该方法具有高度特异性,对犬细小病毒、犬腺病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒无交叉反应,敏感度可达40 copies/μL,是常规RT-PCR方法的100倍。     

基于便携式荧光定量PCR仪的猪瘟病毒现场检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒疫苗株和强毒株一步法双重荧光RT-PCR鉴别检测方法。研究参照GenBank中猪瘟病毒疫苗株以及强毒株特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测猪瘟病毒疫苗株和强毒株的双重荧光RT-PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。本试验建立的TaqMan-MGB一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法可对猪瘟病毒疫苗株和野毒株进行快速鉴别诊断,为猪瘟的净化奠定了基础。     

一株鸽源新城疫病毒的分离鉴定

从广东发病鸽群中采集的拭子样本中分离到1株新城疫病毒,用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)及基因测序等对其进行鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且可与新城疫病毒标准阳性血清发生特异性抑制反应;用针对新城疫病毒的F基因及P基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,可扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明,其与美国新城疫病毒分离株Pigeon/US(TX)/98的F基因核苷酸序列相似性高达97%以上。毒株被鉴定为鸽源新城疫病毒,并命名为Pigeon/Guangdong/ZQ-17。     

鸡传染性法氏囊病病毒血清亚型的研究

自内蒙古、北京、山东、江苏、浙江和广东等六省市的鸡群中分离到13个法氏囊病病毒(IBDV)株(NM、J_1、LQ、LD、ZC、SH、SJ、SY、SNT、SNY、SW、ZH 和 SZ 株),用这些毒株和标准强毒 DCA 株与3个 IBDV 血清Ⅰ型弱毒疫苗株(Lukert.B-2和 TAD 株)分别接种豚鼠或家兔,制备针对各 IBDV 株的特异性高免血清.作微量交叉中和试验。中和试验结果证明,13个野毒株和 DCA 株均属 IBDV 血清Ⅰ型毒株。17株 IBDV 的交叉中和试验结果表明17个 IBDV 毒株之间的抗原 R 值为0.13～1.19,经统计学分析,可分为8个血清亚型、国内六省市分离到的13个 IBDV 株分属4个亚型,DCA 株和3个弱毒疫苗株属另外4个不同的亚型,这些结果不仅说明在我国流行的 IBDV 株间抗原性存在显著差异,而且也证明野毒株与引进的弱毒疫苗株之间抗原性也存在显著差异.从而可以证实 IBDV 血清亚型株在我国的存在是造成免疫失败的一个重要因素.作者认为,今后研制和改进的 IBD 疫苗应由代表我国主要亚型的 IBD 毒株组成.将可能对国内流行的 IBDV 提供最大可能的保护。     

六株鸽源新城疫病毒的分离、鉴定及生物信息学分析

新城疫是严重危害世界养禽业的一种禽类传染病。近年来,鸽新城疫的流行越来越严重,引起了养殖户和兽医工作者的广泛关注。本研究在4批发病鸽组织病料中分离到了4株鸽源新城疫强毒株和2株鸽源弱毒株。病毒分离株经鸡胚有限稀释法纯化5次后,新鲜尿囊液用于提取病毒RNA。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。通过对F基因的遗传进化分析发现,4株鸽源强毒株属于ClassⅡ基因Ⅵb亚型,2株鸽源弱毒株与Class II基因II型疫苗株La Sota高度同源。进一步遗传进化分析结果显示,4株鸽源新城疫病毒强毒株与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与欧洲流行株亲缘关系十分相近,而与中国20世纪90年代鸽源分离株遗传距离稍远,因此推测当前鸽源流行强毒株可能源自欧洲。生物信息学分析显示鸽源毒株HN蛋白345~353位的一个线性抗原表位发生了改变,而血清学实验显示La Sota疫苗株和鸽源毒株的交叉血凝抑制存在明显差异,暗示鸽源毒株已经发生了抗原性变异。因此,使用鸡疫苗株La Sota免疫鸽存在免疫失败的风险,需要研发鸽专用新城疫病毒疫苗用于鸽新城疫的防疫工作。     

猪细小病毒血凝抑制试验抗原、阳性血清与阴性血清的制备与鉴定

猪细小病毒（Porcine Parvovirus,PPV）血凝抑制试验抗原、阳性血清和阴性血清在猪细小病毒制品的效力检验中不可或缺,对猪细小病毒相关生物制品的质量控制至关重要。试验采用PPV 7909株病毒同步接种PK-15细胞制备血凝抑制试验抗原,用制备的抗原乳化后免疫豚鼠制备阳性血清,同时用未免疫的阴性豚鼠制备阴性血清。对抗原、阳性血清和阴性血清进行鉴定,结果表明,制备的PPV血凝抑制试验抗原HA效价达1:512;阳性血清HI效价达1:1024;阴性血清HI效价＜1:8,且特异性均良好。利用制备的血凝抑制试验抗原、阳性血清与不同PPV疫苗株的灭活抗原、阳性血清进行交叉反应试验,结果表明,制备的抗原与阳性血清具备良好的血清学交叉反应性,可用于PPV制品的统一评价。     

蓝舌病病毒分离株的定型研究

用国际标准蓝舌病病毒(BTV)型特异性血清和新制备的BTV型特异性血清,按OIE推荐方法进行蚀斑抑制试验,并试用“悬浮法”蚀斑抑制试验,对BTV分离株(L001)作了血清型鉴定,结果表明该分离株为BTV16型。与标准毒株相对照,两者试验结果完全一致;L001株的RNA的PAGE电泳带谱与BTV16型标准株的带谱相同。     

基于Taqman-MGB探针的猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法的研究

应用MGB荧光RT-PCR技术对猪瘟病毒野毒株进行实时定量检测,以实现对猪瘟病毒野毒株与疫苗株的鉴别诊断。以猪瘟病毒5’端非编码区为扩增靶区,通过鉴别诊断位点的筛选、引物、探针和反应条件的优化,建立了猪瘟病毒野毒株荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应或3.0 TCID50/反应;对猪瘟病毒野毒株的检测结果均为阳性,而对猪瘟病毒疫苗株和其他猪源病毒的检测结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性;对515份临床样品的检测结果表明,该方法与RT-nPCR测序法的检测符合率为98.3%;猪瘟病毒人工感染猪实验结果表明,猪瘟野毒感染猪发病前2-4天即可被检测出阳性,疫苗免疫株检测结果始终为阴性。     

两株狂犬病病毒强毒株糖蛋白基因的克隆及潜在抗原表位分析

通过RT-PCR分别获得了狂犬病病毒强毒CVS株、DRV82株糖蛋白基因,进行克隆及测序,并推导出氨基酸序列,与犬用疫苗弱毒株ERA、SRV9、犬源性街毒株CGX及人用疫苗株PG的糖蛋白序列进行比较。结果表明,以上狂犬病病毒毒株间的核苷酸同源性为83.1%～99.2%,氨基酸序列同源性为87.0%～98.5%。经Jameson-Wolf抗原表位优势图分析,CVS株与其他各株相比发现在304位、372位抗原表位优势升高;而DRV82株与其它各株差异不明显。抗原优势变化可能导致狂犬病病毒糖蛋白出现新的潜在抗原位点,为下一步构建不同毒株的狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗奠定了基础。     

血凝性脑脊髓炎病毒血凝抑制试验方法的研究

为检测某猪场的猪感染血凝性脑脊髓炎病毒的情况,用250 mL/L 的鸡红细胞和200 g/L的高岭土去除非特异性物质,使用4单位抗原及5 mL/L鸡红细胞做HI 试验,发现这些条件较适宜。用此法对其他5 种猪传染病抗血清进行检查,发现均不产生非特异性血清学反应。另外,本试验用滤纸吸附血清与分离血清做HI比较试验,其HI价差异不显著,从而为以后进行血清学调查提供了一种便利的方法。用分离的HEV与日本HEV 67N毒株抗原进行比较,两者的HI价一致。     

用抗传染性法氏囊病病毒中和性单克隆抗体建立的反向间接血凝抑制…

用型特异性中和性单克隆抗体的腹水或细胞上清液直接致敏经双醛化固定的绵羊红血球。致敏血球与作者保存的１６株传染性法氏囊病病毒都能特异性结合具有高度的敏感性。用致敏血球建立了微量反向血凝抑制试验用于法氏囊病病毒抗体的检测。该试验的敏感性是琼脂扩散的２５６倍，与夹心阻断ＥＬＩＳＡ相近；与细胞中和试验的相关系数为０．９８０８；测得雏鸡法氏囊病的被劝免疫临界线为４。测得雏鸡法氏囊病母源抗体的变化规律是：３日     

猪圆环病毒1型感染性克隆的构建与病毒拯救

用PCR法扩增猪圆环病毒1型（PCV1）全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pUC19质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalI酶切位点作为分子靶标,拯救出带有分子标记的克隆病毒,命名为recPCV1／G株。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）在病毒感染细胞中检出病毒抗原,其抗原性仅与PCV1／Cap蛋白单价特异性抗体发生反应,而与抗PCV2／Cap蛋白抗体无交叉。克隆毒株基因组内插入一个SalI酶切位点,可用PCR结合限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）与亲本病毒相鉴别。该毒株经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定,病毒滴度达10^4.8 TCID50/mL。构建的PCV1感染性克隆,为今后开展该病毒的起源与演化、遗传变异规律、分子鉴别诊断等研究奠定了基础。