茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和序列分析

从茶树叶片中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,分别用三对PCR引物扩增SAM合成酶基因的中间主片段、 3 端和 5 端片段 ,最后经BLAST比较及重叠区域拼接得到完整的SAM基因序列。所得序列长 130 3bp ,编码 394个氨基酸。与中华猕猴桃、番茄、长春花SAM合成酶基因的核苷酸序列的同源性分别为 87% ,83 %和 83%。氨基酸序列与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列的同源性为 92 %～ 90 %。证实所获得的基因序列为茶树SAM合成酶基因     

苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析

利用本地BLAST工具,从先期获得的苎麻转录组数据中发掘出与多种植物纤维素合成酶基因有较高同源性的序列CL6473.以苎麻（Boehmeria nivea）栽培种湘苎3号为材料,根据CL6473设计引物,先采用PCR扩增克隆了苎麻一个纤维素合成酶基因cDNA的核心片段,再运用5′及3′RACE获得该基因全长cDNA,序列分析表明该cDNA为一个新的苎麻纤维素合成酶基因cDNA,命名为BnCesA4.BnCesA4cDNA序列全长4008bp,其中编码区全长3270bp,编码一个含1090aa的多肽,具有植物纤维素酶的保守结构域及特征氨基酸序列.根据该cDNA高可变区序列设计其特异性引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对BnCesA4基因在几个代表性苎麻品种：湘苎3号、湘苎1号、湘潭大叶白及城步青麻的木质部和韧皮部两种组织中的表达情况进行了定量分析.qRT-PCR显示BnCesA4基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部均有表达,表达量差异不大.     

木奈果实中花青素合成酶基因PsANS的克隆及原核表达分析

根据NCBI数据库中已知的蔷薇科植物花青素合成酶基因序列设计特异引物,从本实验室已经构建好的木奈成熟果实均一化全长cDNA文库中筛选分离得到了一个编码花青素合成酶的cDNA:基因命名为PsANS,登录号:JN560957。该cDNA长1 478 bp,包含137 bp 5’非编码区,267 bp 3’非编码区,开放阅读框长度为1 074 bp。PsANS编码358个氨基酸,分子量为40.41 ku,理论等电点为5.35。经BLAST分析对比发现,PsANS氨基酸序列与甜樱桃、苹果和草莓的ANS氨基酸同源性都很高,分别为98%、93%和89%。将PsANS亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和pET-32a上,在大肠杆菌BL21中经1mmol/L ITPG诱导表达获得了木奈PsANS融合表达蛋白,其分子量大小与预期的一致,进一步确认本试验克隆得到的PsANS为木奈花青素合成酶基因。     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

香蕉枯萎病菌esyn1基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法扩增了香蕉枯萎病菌恩镰孢菌素合成酶基因esyn1的cDNA片段,测序结果表明,esyn1基因核苷酸序列阅读框架全长546 bp。核苷酸序列分析显示该基因片段编码181个氨基酸,推测分子量为19.9 ku,等电点为5.06。氨基酸序列比对结果表明,它与半裸镰刀菌、层出镰刀菌、拟枝孢镰刀菌esyn1基因的氨基酸序列的相似性分别为96%、94%、77%。     

香蕉ACC合成酶含3＇末端的cDNA克隆

采用3'RACE方法对香蕉(Musa AAA Cavendish Subgroup)ACC合成酶含3'末端的cDNA进行扩增,扩增产物被克隆到pCR*2.1载体上,转化大肠杆菌DH5α,筛选到重组质粒(pACS2),并对插入片段进行序列测定。结果表明,3'RACE产物长1 680 bp,其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸,氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269 bp的3'末端,并具有完整的Poly(A)尾(24mer)。     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.     

香蕉ACC合成酶含3′末端的cDNA克隆

采用3′RACE方法对香蕉（Musa AAA Cavendish Subgroup）ACC合成酶含3′末端的cDNA进行扩增，扩增产物被克隆到pCR2.1载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选到重组质粒（pACS2），并对插入片段进行序列测定。结果表明，3′ARCE产物长1680bp，其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸，氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269bp的3′末端，并具有完整的Poly（A）尾（24mer）。     

辣椒MADS-box基因CaMADS的及表达分析

根据植物MADS-box基因的保守区设计简并引物,进行PCR扩增获得一个辣椒MADS-box基因片段,在此基础上通过RACE方法获得了辣椒编码MADS-box基因的cDNA序列(命名为CaMADS).序列分析结果表明,CaMA DS基因全长943 bp,含有744 bp的阅读框,25bp的5'-UTR和174 bp的3...     

光叶花生两个重要基因片段的克隆和序列测定

从不亲和野生花生Arachis glabrata Benth中提取DNA，在多重序列比对的基础上设计PCR引物，成功扩增出约350、750bp的两个片段，与DES和RS基因片段预期分子量相符。PCR产物与T栽体连接，转化受体菌XL1-Blue，获得了白色菌落，挑取白色菌落在液体培养基中过夜培养，经TTE溶液和热处理后进行PCR扩增，获得了载有目的基因片段的阳性重组子，测序和序列比对分子的结果说明，DES和RS基因片段克隆成功。这是首次从不亲和野生花生A.glabrata Benth中克隆出的基因片段，该片段可用作探针克隆相关基因全编码区。