油桐丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶的克隆与序列分析

为了深入了解油桐丙二酰单酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶(Malonyl Co A:ACP transacylase,MCAT)在油脂合成代谢过程中的作用,利用RT-PCR技术克隆获得了油桐MCAT基因序列,且命名为Vf MCAT,并利用相关生物软件对该基因序列及其相应蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明:Vf MCAT的CDS长为1 179 bp,编码392个氨基酸;该蛋白与蓖麻和亚麻的MCAT同源性均达85%,存在"GXSXG"和"GQGXQ"两个高度保守的motif,在系统进化关系上,其与蓖麻和亚麻的亲缘关系最为接近;分析其氨基酸序列后发现,Vf MCAT的分子量约为41.67 KDa,理论等电点p I为8.43,是一个含有一个跨膜结构域的可溶性稳定蛋白;对其二级和三级结构的预测结果表明,该蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,且最有可能在线粒体中发挥其主要作用,文中由此推测,Vf MCAT在叶绿体中参与了油桐脂肪酸合成代谢。     

油桐LACS4基因的克隆与原核及真核表达

长链酰基辅酶A合成酶(LACS)在油脂代谢过程中发挥着重要的作用。以油桐近成熟种子为材料,在已构建的转录组数据库基础上,克隆得到一个油桐长链酰基辅酶A合成酶基因,在此基因c DNA全长序列的基础上,成功构建了油桐LACS4基因的真核表达和原核表达载体,其中,酵母表达载体p YES2-LACS4成功转入酿酒酵母菌株INVSc1中,并进行相关生长趋势分析;在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中,原核表达载体p ET30a-LACS4也成功诱导表达,并获得大约为74k Da的表观分子量的相应目的蛋白。     

利用油茶油体蛋白系统表达金属硫蛋白的载体构建

利用油体蛋白表达系统生产活性蛋白,是一种利用生物反应器生产高纯度无污染活性肽的新方法。为给后期油茶油体蛋白表达系统的开发应用提供依据,分别以油茶油体蛋白基因和油茶金属硫蛋白基因为模板设计引物,PCR扩增获得CDS片段,通过酶切连接构建p ET30a重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达,在此基础上将两者二次重组,成功构建油茶油体蛋白金属硫基因表达载体。     

油茶ACP基因的全长cDNA克隆及序列分析

酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质,位于脂肪酸合成酶系的中央,作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列.结果表明：油茶酰基载体蛋白基因的全长cDNA为669bp,包含1个完整的CDS及3′UTR和5′UTR,编码141个氨基酸,该基因被命名为co-acp并提交至GeneBank,登录号是EU717697;油茶酰基载体蛋白基因的推导氨基酸序列与其它15种植物的ACP进行AlignX比较的结果表明,油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高,而且遗传距离最近;预测油茶酰基载体蛋白的二级结构以α螺旋为主,没有跨膜结构域和信号肽,其等电点约为4.995.     

普通油茶两个Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列特征及表达模式研究

[目地]研究普通油茶油脂成分形成的调控机制。[方法]通过转录组测序获得2条普通油茶Δ-12脂肪酸脱氢酶基因序列,分别命名为Cofad6和Cofad2-2,并对这两个基因及其编码蛋白的序列特征进行比较,对其基因表达量与脂肪酸成分含量的相关性进行分析。[结果]Cofad6基因c DNA编码区全长1 347 bp,编码448个氨基酸;Cofad2-2基因c DNA编码区全长1 152 bp,编码383个氨基酸。经比对,Co FAD6蛋白与其余物种FAD6蛋白有65.7%83.68%的氨基酸同源,Co FAD2-2与浙江红花油茶FAD2-2蛋白有99.22%的氨基酸同源,与其余物种的蛋白质78.59%81.72%同源。蛋白质二级结构分析表明,Co FAD6和Co FAD2-2均具有一个脂肪酸去饱和酶结构域,属于脂酰-Co A去饱和酶基因家族;两者均为跨膜蛋白,且Co FAD2-2具有定位于内质网的保守模序。定量PCR检测发现,在普通油茶‘长林4号’无性系未成熟种子中,Cofad6表达量随着种子发育先升高后降低,而Cofad2-2基因随着种子发育表达量逐渐降低,与种子油脂中亚油酸、亚麻酸含量变化趋势呈显著正相关,与油酸含量变化呈显著负相关。[结论]推测Cofad2-2基因是调控普通油茶种子油脂中油酸和亚油酸含量的关键基因之一,该研究为普通油茶油脂改良基因工程育种奠定了基础。     

植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶研究综述

植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶(FAT)是一种终止脂肪酸合成的酶.它的基本功能就是将acyl-ACPs水解成游离脂肪酸和ACP,从而终止脂肪酸从头合成途径中脂肪酸链的延长.植物中,不同的FAT具有不同的底物特异性,直接决定植物细胞油脂中的脂肪酸的种类和数量.不同的植物组织和物种对于每种脂肪酸的需求各不相同,因此FAT在植物细胞代谢中就有着极为重要的作用.本文对FAT的种类、结构、功能、序列的分离克隆及其应用等方面进行综述.     

尾叶桉GLU4肉桂酰-辅酶A还原酶基因克隆及原核表达

肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对EuCCR进行原核表达,重组质粒成功表达分子量约36 kD的目的蛋白。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

杜仲半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因EuCPI的克隆及功能分析

【目的】以杜仲种仁为试材,克隆EuCPI基因全长序列并分析其结构特征,探究该基因的抗逆功能及对黄粉虫生长发育的影响,为今后深入研究其抗逆机制提供理论基础。【方法】提取杜仲种仁的RNA并反转录成c DNA,采用RACE技术扩增EuCPI基因的全长c DNA序列;利用生物信息学网站对其所编码蛋白的理化性质及结构功能进行分析预测;利用pET28a质粒构建原核表达重组载体,对重组蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot及蛋白纯化试验;利用重组的原核表达系统探究在盐胁迫和高温胁迫下含有EuCPI基因的大肠杆菌和对照组之间生长曲线的不同,初步鉴定该基因对大肠杆菌的影响;此外,利用诱导后的重组菌液饲喂黄粉虫,探究EuCPI基因对黄粉虫生长发育的影响。【结果】EuCPI基因具有547 bp的全长序列(GenBank登录号:MT702592),开放阅读框(ORF)为309 bp,编码蛋白由102个氨基酸组成,理论等电点(pI)为6.41,分子质量为11.17 kDa,不稳定指数为27.73,属于稳定蛋白,总平均亲水性为-0.416,属于亲水蛋白。氨基酸序列分析结果表明,EuCPI蛋白无跨膜结构,无信号肽,主要由50%的α-螺旋、36.27%的无规则卷曲、11.76%的延伸链和1.96%的β-折叠组成,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。系统进化树分析结果表明,该蛋白与欧洲栓皮栎CPI编码蛋白同源性较高。通过构建的原核表达载体pET28a-EuCPI,诱导表达并纯化出15.29 kDa大小的重组蛋白。高温胁迫试验生长曲线结果表明,在37℃条件下前10 h含有EuCPI基因的BL21(DE3)大肠杆菌与对照组长势基本一致,而在42℃和50℃条件下前10 h含有EuCPI基因的菌生长速度明显大于对照组,且对照组出现明显的生长抑制情况。固体培养基盐胁迫试验结果表明,随着培养基中Na Cl浓度增加,试验组和对照组菌落均出现生长抑制现象,但含有EuCPI基因的菌落数量明显多于对照组,尤其在0.75 mol·L~(-1)时,前者有较多的单菌落存活而后者无单菌落存活;液体培养基盐胁迫试验生长曲线结果表明,在0.25 mol·L~(-1)NaCl浓度条件下,前8 h含有EuCPI基因的BL21(DE3)大肠杆菌生长速度明显大于对照组,且对照组出现明显的生长抑制现象。饲虫试验结果表明,取食含有EuCPI基因的饲料的黄粉虫体质量呈下降趋势,而对照组体质量呈上升趋势,经数据分析存在极显著差异(P0.01)。【结论】EuCPI基因能够提高大肠杆菌对高温胁迫和盐胁迫的耐受性,含有EuCPI基因的重组菌对鞘翅目昆虫黄粉虫的生长发育有一定抑制作用。     

暴马桑黄SbLSD基因克隆及差异表达分析

【目的】暴马桑黄是一种重要的药用资源,三萜是其发挥药用功效的主要成分,但是目前获取大量三萜仍然非常困难。通过对暴马桑黄三萜合成途径中的羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因进行克隆及差异表达分析,以期深入了解暴马桑黄三萜合成的调控机理,进而提高三萜产量。【方法】采用PCR扩增得到LSD基因cDNA序列全长,利用生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行分析;采取同源重组方法构建原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE检测;qRT-PCR技术分析LSD基因在暴马桑黄不同发育阶段转录水平差异。【结果】暴马桑黄LSD基因cDNA全长1 662 bp,编码553个氨基酸,相对分子量为62.26 kDa,命名为SbLSD(登录号为MN864180);跨膜区和亚细胞定位预测显示SbLSD蛋白是在内质网和高尔基体发挥作用的跨膜蛋白;系统进化树结果表明暴马桑黄和灵芝的LSD蛋白同源性最高,符合物种经典分类;SDS-PAGE结果证实在62.26 kDa附近出现目的蛋白条带,说明所获得的基因可以成功表达出蛋白;从荧光定量分析结果中可以看出SbLSD基因转录水平在不同发育阶段有差异性,并且在子实体阶段该基因转录水平最高,与羊毛甾醇合成的基因变化规律相吻合。【结论】通过对SbLSD基因的分子鉴定解析,为进一步揭示该基因在暴马桑黄三萜合成途径中的功能奠定基础。     

桑树MLX56基因家族特性、克隆及表达分析

【目的】桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。从桑树基因组数据库中鉴定桑树MLX56基因家族,并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析,为桑树MLX56基因的功能研究及利用奠定基础。【方法】利用桑树基因组数据库,采用生物信息学方法,分析桑树MLX56基因家族结构及进化关系,并对MLX56基因家族成员进行鉴定;利用MEGA4.1软件进行系统进化树分析;通过半定量RT-PCR技术研究MLX56基因在桑树不同种及不同组织之间的表达水平,构建原核表达载体p ET-28a-MLX56-6,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段的菌液进行超声破碎,SDS-PAGE检测目的蛋白的可溶性;利用Western Blot印迹验证目的蛋白的表达。并研究该基因对大肠杆菌生长速率的影响。【结果】利用桑树基因组数据库,鉴定6个MLX56家族基因,该家族基因含有2个几丁质结合域,且都含有信号肽,属于分泌蛋白。此外还克隆到1个新的MLX56基因,命名为MLX56-7(Gen Bank登录号为KJ496133)。系统进化树显示桑树MLX56基因与西洋接骨木类橡胶蛋白同源性最高,同源性达66%,与茶树几丁质酶、葡萄几丁质酶同源性较低,同源性分别为49%和48%。半定量RT-PCR分析表明,MLX56-1,MLX56-2,MLX56-4,MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7在桑树不同种中均有表达,组织表达特异性分析表明MLX56-2,MLX56-4,MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7基因在广东桑‘桂优62号’各个组织中都有表达,MLX56-1基因仅在叶柄及茎中表达,MLX56-3基因在桑树不同种及广东桑‘桂优62号’各个组织中都没有检测到表达。原核表达结果表明,MLX56-6蛋白在终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG诱导下成功表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了1个分子量为56 k Da的蛋白。但在诱导表达过程中,大肠杆菌BL21(DE3)生长速率受到MLX56-6基因的抑制。【结论】MLX56基因家族在桑树进化过程中发生了基因的重复,且在结构上出现了分化。根据MLX56基因家族的蛋白及结构特征,该基因家族可能属于具有凝集素活性的几丁质酶。MLX56基因在桑树不同种及不同组织中的表达存在差异,暗示这些基因在桑树不同种及不同组织中的功能存在一定差异。     

转多基因欧美杨Bt基因表达特征

【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨3个株系(A1、A2、A3)和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨3个株系(B1、B2、B3),通过PCR技术对转基因107杨中外源基因进行检测和验证,通过实时荧光定量PCR对Bt基因的转录丰度进行检测,利用ELISA技术对转基因107杨不同时间、不同部位毒蛋白含量进行检测。【结果】PCR检测结果显示,转基因107杨均能扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,阴性对照未扩增出特异性条带,证明外源基因在转基因107杨中稳定存在;实时荧光定量PCR检测结果表明,2种Bt基因在转基因107杨中均能稳定表达,Cry1Ac基因的转录丰度在2.1×10~4～5.1×10~4之间,Cry3A基因的转录丰度在2.8×10~6～5.6×10~7之间,Cry1Ac基因和Cry3A基因转录丰度无相关性; ELISA技术检测结果显示,转基因107杨中均检测到Cry1Ac和Cry3A毒蛋白存在。2种Bt基因转录丰度和毒蛋白含量无相关性,但2种Bt毒蛋白含量之间呈现出正相关关系。转2种不同载体的107杨6、7月份2种Bt毒蛋白的含量较低,8月份急剧上升,Cry1Ac毒蛋白的含量均在9月份达到峰值,Cry3A毒蛋白含量均在8月份达到峰值,10月急剧下降。8月份不同部位(上、中、下)的叶片Bt毒蛋白含量未表现出一致性规律,不同部位(上、中、下)木质部的Bt毒蛋白含量也未呈现出一致性规律。【结论】转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨不同株系间2种Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因; 2种Bt毒蛋白在各株系间存在显著差异,Cry1Ac毒蛋白含量极低,Cry3A毒蛋白含量极显著高于Cry1Ac,与转录水平检测结果一致。2种不同载体之间Cry1Ac基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量无明显差异,Cry3A基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量也无明显差异。在转基因107杨整个生长季中,Cry1Ac和Cry3A平均毒蛋白含量变化趋势基本一致,呈单峰模式。     

赤桉木质素合成途径OMT基因家族的原核表达与纯化研究

双子叶植物的木质素主要由愈创木基单体和紫丁香基木质素单体聚合形成,这两种单体的比例对造纸过程中木质素去除难易程度具有重要的影响。植物OMT基因家族的CCoAOMT和COMT基因是木质素合成途径的关键酶基因,可调控植物体内木质素单体的比例与含量。本文以所克隆的赤桉COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2三个基因的cDNA为模板,分别构建pET-32a的原核表达质粒,并优化在大肠杆菌BL21(λDE3)中的表达体系。结果显示,在加入0.4 mmol IPTG诱导表达后,COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2的原核表达质粒分别在4 h、2 h和3 h后达到可溶性重组蛋白表达峰值。通过渗透休克纯化方法,可在原核表达菌株的周质空间提纯CCoAOMT1和CCoAOMT2重组蛋白,在原核表达菌株的细胞质中可提纯COMT重组蛋白。     

橡胶树胶乳高表达的法尼基焦磷酸合成酶的功能

【目的】天然橡胶生物合成途径是典型的植物类异戊二烯代谢途径,MVA代谢途径是天然橡胶与萜类化合物所需的五碳构成单元IPP和DMAPP生物合成的主要途径之一。由2分子IPP和1分子DMAPP聚合形成的法尼基焦磷酸是乳管细胞天然橡胶生物合成的起始前体,厘清该起始物的合成酶酶学性质不仅有助于阐明天然橡胶生物合成机制,同时也为天然橡胶遗传改良提供酶学理论基础。【方法】对橡胶树热研7-33-97基因组中同源的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶(HbFPS1、HbFPS2、 HbFPS3)进行序列特征分析,优选胶乳中高表达的2个法尼基焦磷酸合成酶基因构建原核表达载体,经蛋白纯化与MALDI TOF质谱确证,并同时进行体外酶活性检测,最终评价其对体外橡胶合成效率的影响。【结果】橡胶树基因组含有的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶都含有特征性的2个保守结构域“DDIMD”和“DDYXD”及相似的三维空间结构,其中胶乳高表达的HbFPS1和HbFPS2基因编码的蛋白氨基酸序列相似性达到95%,说明HbFPS1和HbFPS2 2个冗余基因可能经历了基因组中同源基因的后期拷贝事件。同时HbFPS1和HbFPS2基因能够...     

冷胁迫下普通油茶CCCH型锌指蛋白基因家族的鉴定和分析

【目的】为挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera遗传资源提供参考。【方法】基于普通油茶的冷胁迫转录组数据,对其CCCH型锌指蛋白基因进行鉴定,并对CCCH型锌指蛋白进行理化性质分析、系统发育分析、保守结构域预测、二级结构预测等相关生物信息学分析,并以庐山高海拔油茶(LSG)和栽培油茶品种赣无1(GW1)为材料,对CCCH型锌指蛋白基因在冷胁迫下的表达情况进行分析。【结果】在普通油茶的冷胁迫转录组数据中共鉴定到24个CCCH型锌指蛋白基因,参考水稻分类方法,将24个CCCH型锌指蛋白聚类到2个亚家族中。保守基序分析结果表明,在24个基因中仅有3种CCCH型锌指蛋白基序类型,即C-X8-C-X5-CX3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H,数目分别为92、4和4。转录组表达谱分析结果表明：在野外冷胁迫试验中CoC3H17基因在D4、D5和D6时期的表达量高于D1、D2和D3时期,在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶和赣无1的CoC3H17基因一直表现为更高的转录本丰度;CoC3H14和CoC3H24基因在野外试验的D4、D5和D6时期均表现...     

毛竹肉桂酰辅酶A还原酶基因PeCCR功能初步研究

[目的]为研究肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因表达对竹子木质素生物合成的影响,对毛竹(Phyllostachys edulis (Carrière) J. Houz.)中PeCCR基因的表达情况进行分析,并对PeCCR基因功能进行研究,以期为利用CCR基因在竹子中开展基因工程育种提供参考依据。[方法]采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法对PeCCR基因在毛竹不同组织以及不同高度笋中的表达进行了分析,采用RT-PCR方法克隆了PeCCR基因的编码区,构建了基因过量表达载体,采用蘸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),采用溴乙酰法测定转基因植株茎木质素的含量。[结果]qRT-PCR结果表明:在毛竹实生苗根中PeCCR的表达量最高,其次是笋中,而未展开叶中最低;在野外随着笋高度的增加,木质化程度加强,PeCCR基因的表达量呈上升趋势,在6.7 m笋中达到最高。克隆获得PeCCR编码区长度为1 026 bp,编码一个341 aa的蛋白,具有家族蛋白特有的保守结构域"NWYCYGK"。与野生型拟南芥相比,转PeCCR基因植株叶片明显增大,且抽苔时间提前3~4 d。茎横切的组织化学染色观察发现:转基因植株茎的木质部和束间纤维组织染色面积均大于野生型;木质素含量测定表明,2个过表达PeCCR1转基因株系中的木质素含量均明显高于野生型,分别为野生型对照的123.1%和116.7%。[结论]PeCCR基因在毛竹不同组织的表达存在差异,在笋中随高度增加其表达量上调。过量表达PeCCR促进了转基因拟南芥植株的生长发育,提高了木质素含量。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A 33为材料,通过PCR技术从A 33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列.经过克隆、测序及BLA ST比对分析,证实该基因编码β-甘露聚糖酶,属于β-甘露聚糖酶家族中的一员,该基因已注册G enBank.将该基因克隆到原核表达载体pRSET-A中并转入大肠杆菌表达系统BL 21(DE 3)pLysS,经过诱导获得了此酶的高效表达.其表达量达到37.78 U/mL,酶学特性分析表明其作用的最适pH为5.0,最适温度为60℃.     

油茶油脂的生物合成及调控基因的特性

茶油在种子内主要以油体形式存在,因而油体蛋白的数量与种类决定了油体的数量与特性,在长期进化中油体蛋白基因失去了内含子,可促进油体蛋白的快速表达.茶油生物合成过程中涉及了大量酶与蛋白质的参与,其中丙二酸单酰C oA决定了饱和脂肪酸的合成速度;硬脂酰ACP脱饱和酶直接控制不饱和脂肪酸的含量;油酸脱饱和酶控制多不饱和脂肪酸的含量与种类.还需克隆相关基因的全长cDNA,并通过分子生物学技术确定这些基因的功能与调控机理.     

不同木质底物诱导下白囊耙齿菌胞外木质纤维素酶活性和胞内蛋白质组的差异

【目的】研究白囊耙齿菌5种胞外分泌木质纤维素酶活性变化以及胞内蛋白质组的表达差异,探讨该菌对不同基质的利用机制,为筛选用于生物制浆、林木病腐防治和工业污染物降解的高效菌株提供科学依据。【方法】选用白桦、红皮云杉木屑作为诱导物,不加木屑为对照,研究白囊靶齿菌5种主要胞外分泌木质纤维素酶的活性以及胞内蛋白质组的表达差异。【结果】木屑诱导下的木质纤维素相关胞外酶活性大都高于对照样品,且锰过氧化物酶和漆酶活性在处理组与对照组间的差异达显著和极显著水平;木质素降解酶系中漆酶活性最强,木质素过氧化物酶次之,锰过氧化物酶最弱;纤维素降解酶系中葡聚糖外切酶活性远大于葡聚糖内切酶活性,2种酶活性总体上趋于稳定,表达量较高,受培养时间的影响变化不明显;白桦和云杉木屑处理组中检测到32个胞内明显差异表达蛋白点,2个处理组各有3个特异的差异表达蛋白点。白桦木屑诱导下的特异表达蛋白与膜蛋白、膜运输和能量提供有关,而云杉诱导组特异表达蛋白均与蛋白合成有关。【结论】不同树种木屑底物诱导下白囊耙齿菌胞外木质纤维素酶活性存在显著差异。同时胞内蛋白质的表达也存在明显差异,在分解白桦木屑时分泌蛋白的胞内外运输可能是决定木材降解能力的关键,而在分解云杉木屑时其相关分泌蛋白的大量合成将起决定作用。     

Co-rrp基因小干扰RNA载体的构建及烟草中的遗传转化

为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。     

麻疯树AP2/ERF基因家族孤儿基因Soloist的克隆与原核表达分析

【目的】含有AP2结构域的AP2/ERF蛋白是与植物抗逆性密切相关的转录因子家族,Soloist是AP2/ERF家族中的孤儿基因,大部分植物只有1个。克隆麻疯树该基因编码框的全长c DNA序列,并对其理化性质、基因结构、启动子区域调控元件、表达特性及蛋白原核表达进行分析,为深入开展麻疯树Soloist基因的功能鉴定及其在麻疯树遗传改良中的应用提供依据。【方法】利用AP2结构域的隐马尔可夫模型结合拟南芥与水稻的Soloist蛋白序列对麻疯树蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得麻疯树AP2/ERF基因家族成员。利用不同的工具对Soloist基因进行生物信息学对比分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在麻疯树不同器官及低温处理下的相对表达量。通过双酶切构建该基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行IPTG诱导表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。【结果】共鉴定到119个麻疯树AP2/ERF家族基因,其中包含1个Soloist基因,命名为Jc Soloist。序列分析显示,麻疯树Jc Soloist基因编码框长度为699 bp,编码232个氨基酸,预测分子量为26.3 k Da,理论等电点为9.65,包含6个外显子与5个内含子。在其基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框,以及赤霉素、水杨酸及干旱等应答元件。表达分析显示,麻疯树Jc Soloist基因在麻疯树各器官中都有表达,但表达水平具有器官特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在叶片与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照提高34.38倍与3.83倍。构建了p ET-32a-Jc Soloist重组载体,且在原核细胞中稳定表达,SDS-PAGE结果显示融合蛋白分子量为46.0 k Da,与预期大小一致。【结论】麻疯树AP2/ERF基因家族鉴定到1个Soloist基因,包含由3条反平行β-折叠与1条α-螺旋组成的AP2结构域,与其他物种的报道一致。基因启动子区域鉴定到赤霉素、水杨酸等顺式作用元件,暗示该基因在麻疯树激素信号转导中发挥重要作用。Jc Soloist基因在麻疯树叶片与根中受低温诱导表达显著,说明该基因参与麻疯树低温响应过程以及低温信号转导途径,也成为麻疯树抗冷新品种选育的候选基因。