桉树PAL基因克隆及焦枯病菌诱导下的表达分析

[目的]克隆桉树苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及在焦枯病菌诱导下的表达特征,为探究桉树抗焦枯病机理提供理论支撑。[方法]通过SOE-PCR技术从尾细桉M1中克隆PAL基因,利用real-time PCR分析其在焦枯病菌诱导下的表达特性。[结果]克隆得到尾细桉M1 PAL基因,其ORF序列长2 142 bp,编码713个氨基酸,与其他已发表的桉树PAL相似性均在99%以上。序列分析发现,其编码蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,具有典型的苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构域。进一步分析桉树不同品系PAL基因的表达趋势,结果发现,不同品系PAL基因在焦枯病菌诱导下均表现为明显的上调表达,且抗性越强,PAL基因越早上调,上调表达量越大。[结论]从尾细桉M1中克隆得到的PAL基因具有典型的PAL家族成员特征,推测该基因可能通过参与酚类防御性物质或者信号分子SA等物质的合成,进而在桉树抵抗焦枯病菌侵染的过程中发挥重要作用。     

马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)克隆及分析

对马尾松肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)进行扩增、克隆和测序(GenBank登录号:EU753854).应用MEGA4.0.2软件对不同树种CCR基因的核苷酸和氨基酸序列进行比对,结果表明:马尾松CCR基因的外显子和内含子数目与火炬松、杨树、银合欢、光皮桦、冈尼桉、柳桉、蓝桉的外显子和内含子数目相同,都有5个外显子和4个内含子.马尾松CCR基因编码区975 bp,编码324个氨基酸.马尾松外显子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ分别为133,155,186,353,148 bp,而内含子Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ分别为1 450,216,737,941 bp.马尾松CCR外显子和内含子连接处序列除内含子Ⅱ/外显子Ⅲ出现CTPuCG/外显子Ⅲ,其余遵循外显子/GTPuAG/外显子组成规律.马尾松外显子Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ核苷酸数目与桉属、杨属、桦木属和松属树种相同,但外显子Ⅰ和外显子Ⅴ不尽相同.比对的树种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上相对保守,也存在一定差异.马尾松与火炬松、光皮桦、银合欢、杨树、冈尼桉、柳桉、蓝桉各物种间编码区核苷酸序列相似性大小分别为99.2%,67.8%,68.0%,68.9%,69.5%,69.3%,69.9%,而相应的氨基酸序列间相似性大小分别为99.1%,73.5%,72.5%,74.4%,75.0%,74.4%,75.0%.马尾松与其他13个树种CCR序列构建的系统进化树表明:3个针叶树种形成1个独立分支,而且最早进化.     

巨龙竹肉桂醇脱氢酶基因(DsCAD)的克隆及功能分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)是木质素生物合成途径的关键酶。研究根据巨龙竹转录组数据设计的一对特异引物,运用逆转录PCR(RT-PCR)技术从巨龙竹茎秆中克隆得到肉桂醇脱氢酶基因DsCAD,该基因包含1080 bp的完整c DNA开放阅读框,编码359个氨基酸,理论相对分子质量38689.6,等电点6.18。利用生物信息学方法对DsCAD进行分析,结果显示:DsCAD氨基酸序列包含CAD超家族的保守结构域,具有植物CAD基因的典型特征;其与禾本科植物CAD基因的同源性较高,亲缘关系较近,其中与孝顺竹的同源性高达95%。荧光定量PCR检测结果显示DsCAD基因在巨龙竹竹笋中的表达量要高于茎秆,而在茎秆中的表达量有明显高于叶。     

欧美杨107木质素生物合成酶CCR基因的克隆及其鉴定

木质素作为草类饲料消化性的限制因子,直接影响饲料的利用率,而CCR是木质素生物合成关键酶之一。从正在分化的2a生欧美杨107次生木质部RT-PCR扩增出的基因片段,与pMD20-T载体连接,重组质粒经限制性内切酶酶切、特异引物PCR扩增和测序鉴定。结果表明该扩增片段长为961bp,含一个编码301氨基酸的完整开放阅读框,其核苷酸序列与Leple等发表的白杨杂种Populus trichocarpa CCR的cDNA序列(AJ224986)同源性达到98.2%,并且反向插入到pMD20-T载体,因此构建了CCR的反义大肠杆菌表达载体,为后续的基因操作打下基础。该基因序列已提交国际核苷酸序列库,登录号为AM921698。     

CODEHOP在线简并引物设计与杉木4CL基因片段克隆

利用CODEHOP设计4CL酶的简并引物,利用设计的3对简并引物进行RT—PCR,从杉木幼茎中克隆到2个长度分别为502bp和536bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过Blastx检索与Genbank进行同源性比对后,发现2片段都与其它植物的4-CL基因具有较高的氨基酸序列同源性。研究表明,该程序设计的简并引物可信性强,阳性率高。该基因的成功克隆将为研究杉木木质素的合成提供科学依据。     

马尾松GGPPS基因克隆及序列分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是萜烯类物质合成的关键酶之一,本研究通过同源序列检索分析设计引物,从马尾松幼苗针叶组织中克隆到其GGPPS基因,命名为Pma GGPPS,该基因c DNA长1 143bp,开放阅读区编码380个氨基酸。Pma GGPPS编码的蛋白质序列分析显示具有Trans IPPS结构域及FARM、SARM两个富含天冬氨酸区域,序列特点与GGPPS蛋白的酶学功能相符。同源性分析结果显示Pma GGPPS核酸序列与其他两种松属植物GGPPS基因同源性达到99%以上,Pma GGPPS编码蛋白与挪威云杉等植物中GGPPS蛋白同源性也在69%以上。对Pma GGPPS编码蛋白进行理化性质及结构的生物信息学分析,结果显示该蛋白为一种无信号肽、无跨膜区的碱性蛋白质,二级结构由16段α-螺旋组成,三级结构同源建模显示与欧薄荷的异聚牻牛儿基焦磷酸合酶大亚基同源性最高。系统进化树分析显示该蛋白与红豆杉、银杏亲缘关系较近。本研究中克隆得到Pma GGPPS基因为深入研究其在松脂合成的影响奠定了基础,同时根据GGPPS基因设计荧光定量引物并优化反应条件,为下一步研究基因表达水平与产脂力关系提供了理论依据和技术参考。     

巴拉圭瓜多竹CCR基因的克隆与分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-Co A reductase,CCR)是木质素生物合成途径中关键酶。本研究依据转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法成功地从巴拉圭瓜多竹(Guadua paraguayanan)中克隆得到一个全新的CCR基因的全长cDNA序列,命名为GpCCR。序列分析结果表明,GpCCR包含完整的c DNA开放阅读框(ORF),由1065bp组成,编码354个氨基酸。Blast比对结果显示该蛋白质属于CCR家族蛋白;系统进化树结果显示瓜多竹与禾本科植物大麦、水稻等亲缘关系较近。荧光定量PCR检测显示GpCCR在巴拉圭瓜多竹的茎秆中表达量最高,在叶中表达量最低。     

毛竹木质素合成相关基因C4H的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从毛竹中克隆了C4H基因cDNA全长序列。该基因包含1 506 bp开放读码框,编码502个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中序列进行比对, 结果表明该基因与单子叶植物高粱、水稻和玉米中的C4H基因同源性较高,分别达到88%、88%和87%。经过荧光定量PCR分析,该基因在毛竹不同发育时期和不同组织中表达丰度不同,在冬笋中表达量最高,其次为春笋顶部、中部、叶、3年生茎、根、叶鞘、2年生茎、春笋、1年生茎,而在春笋基部中表达最低。在笋顶部、中部的高水平表达表明本文克隆的C4H基因与发育时期维管组织的细胞壁加厚相关,可以作为调控木质素合成的目标基因用于竹子基因工程改良。     

杯果木CCR基因克隆和同源进化分析

从粗毛杯果木和软叶杯果木基因组中克隆CCR基因,经测序验证扩增片断长度均为2321bp,包含部分外显子3、4和部分5,以及内含子3和4。同源性比较分析表明:粗毛杯果木与伞房属树种CCR的同源相似性达到98%～87%,与桉属树种CCR的同源相似性达到97%～84%;而软叶杯果木与伞房属树种CCR的同源相似性达到98%～87%,与桉属树种CCR的同源相似性达到95%～84%。总体上,该2个杯果木树种与伞房属CCR同源相似性较高,而与桉属CCR同源相似性较低。3个属中最长保守序列位于Exon5的第3147～3175位点,共29个碱基。保守区域主要集中于Exon5,少数于Intron4。桉属总变异率大于杯果木属和伞房属。桉属Exon4变异率大于属内其它Exon或Intron;同样发现Exon4的简约信息位点百分数大于属内其它Exon或Intron,但杯果木属中的Intron3变异率高于属内其它Exon或Intron。伞房属以Exon5的变异率最高。Exon或Intron平均变异率均以桉属最多,其次是杯果木属,最少的是伞房属。使用MEGA3.1软件构建的CCR进化树表明,桉属、伞房属和杯果木属分别形成单系,其亲缘关系可...     

七彩红竹IhCCR-1基因的克隆与分析

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是苯丙烷类代谢途径中的关键酶,在七彩红竹木质素和花青素合成代谢流向中起重要作用。依据七彩红竹转录组数据设计特异引物,采用反转录PCR技术从七彩红竹中克隆得到一个新的CCR基因的全长cDNA序列,命名为IhCCR-1(登录号:KP271440)。结果表明,该基因全长cDNA为1 038 bp,编码345个氨基酸的蛋白质,属于酸性稳定蛋白,不存在信号肽,为非分泌蛋白;IhCCR-1蛋白具有保守的KNWYCYGK催化位点,属于NADB-Rossmann超家族,相对分子量为37.61 kDa;Ih CCR-1与其他植物的CCR具有较高的亲缘关系。研究结果将为进一步研究七彩红竹木质素产生的分子机理和综合开发利用奠定基础。     

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

甜橙液泡转化酶基因(CSVI)的分离及全序列分析

根据不同植物液泡转化酶基因序列的保守区设计合成引物，采用滤纸吸附噬菌体PCR法，首次从甜橙基因组文库筛选出含甜橙液泡转化酶基因的阳性X噬菌体，经过大量培养并提取其DNA，限制性内切酶消化后进行DIG southern印迹分析，将阳性条带回收、加工并克隆测序。序列分析表明，该基因全长4722bp，编码588个氨基酸，包括6个外显子和5个内含子。在GenBank进行Blast检索的结果表明，该基因编码的氨基酸序列与马铃薯、番茄和酸樱桃液泡转化酶基因编码的氨基酸序列同源性分别为68％、68％和62％。系统进化关系聚类分析结果表明，该基因属液泡转化酶基因类型。该基因已经在GenBank登录(登录号：AF433643)。该基因的获得为从分子水平研究柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解机制以及通过基因工程改良果实品质奠定了基础。     

桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的克隆、原核表达与植物表达载体的构建

景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶.利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号;DQ995346).MSBPase全长为1 527 bp,该序列含有1个1 179 bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6 ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性.对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(strand)只有13.52%.将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a( ),并转化到大肠杆菌菌株 BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达.将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121.SBP.     

马尾松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、木质素等次生代谢产物的合成。根据其他植物PAL基因的DNA保守序列设计的简并引物,经过PCR扩增,得到1条864 bp的特异性片段,编码288个氨基酸。通过分析其序列和编码的氨基酸序列,发现其与其他物种的PAL基因高度同源,证实为马尾松PAL基因的核心序列。所得序列已经登陆在NCBI的Genbank中,序列号为GQ142010。     

天女木兰种子天冬氨酸蛋白酶基因的克隆与分析

天冬氨酸蛋白酶在天女木兰种子萌发过程中发挥着重要作用。以天女木兰种子为试验材料,利用同源克隆法RACE技术,从天女木兰种子中克隆得到天冬氨酸蛋白酶基因,全长1 545 bp,可以编码514个氨基酸残基。同源性分析显示,目的序列推导的氨基酸序列与其它植物中已知的天冬氨酸蛋白酶基因的氨基酸序列的同源性都在85%以上;采用生物信息学的方法进行分析,初步预测该基因编码的蛋白属于跨膜的分泌蛋白,大部分区域属于疏水结构;结构域的预测分析显示,此类蛋白包含约100个植物组织蛋白酶所特有的区域,该区域可能在植物液泡中发挥着重要作用。本研究为下一步系统、全面地研究天女木兰种子休眠的分子机理奠定了基础。     

七彩虹竹4-香豆酸辅酶A连接酶基因(Ih4CL)的克隆及功能分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶,在上游调控木质素代谢、黄酮代谢。本研究根据转录组数据设计的1对特异引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法从七彩红竹1年生红秆中克隆到4-香豆酸辅酶A连接酶基因Ih4CL,该基因包含1 677bp完整的c DNA开放阅读框,编码558个氨基酸;生物信息学方法对Ih4CL编码的氨基酸蛋白序列进行的分析表明,Ih4CL与禾本科植物4CL蛋白具有较近的亲缘关系,其中与短花药野生稻的同源性达88%;荧光定量PCR检测结果显示Ih4CL基因在七彩红竹的嫩叶中的表达量明显低于茎秆中的表达量。     

滇牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析

ω-6脂肪酸脱氢酶(FAD2)是亚油酸合成的关键酶,催化油酸脱氢形成亚油酸。以滇牡丹种子为材料,研究根据转录组数据设计的特异引物,采用RT-PCR方法,克隆滇牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(FAD2)并分析其功能。获得一个ω-6脂肪酸脱氢酶基因,将其命名为Pd FAD2。结果表明,该基因与芍药的同源性为98.7%。经氨基酸序列比对,推断滇牡丹FAD2具有植物FAD2特有的3个组氨酸区,包含完整的c DNA开放阅读框,由1 155bp组成,编码384个氨基酸残基。半定量PCR的结果显示,滇牡丹FAD2基因在花、茎、叶、种子中均有表达,在根中只有微弱表达。研究结果为研究滇牡丹不饱和脂肪酸代谢奠定基础,也为油用滇牡丹育种提供理论依据。     

油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。     

苹果属无融合生殖SERK1基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为探讨苹果属植物无融合生殖分子机制。[方法]以苹果属平邑甜茶及杂种后代33#为试材,以苹果基因组CDS序列设计引物,通过PCR扩增技术克隆出SERK同源基因的cDNA全长序列,命名为MhSERK1和MhdSERK1(GenBank登录号JQ231273和JQ231272),利用实时定量RTqPCR的方法检测了这两个基因在平邑甜茶和杂种后代各组织和器官中的表达模式。[结果]序列分析显示MhSERK1和MhdSERK1编码区序列全长为1 899 bp和1 881 bp,分别编码632和626个氨基酸,其氨基酸序列与其他植物的SERK1同源基因所编码的氨基酸同源性都在80%以上,特别是与葡萄科龙眼品种同源性最高,高达92.56%,与模式植物拟南芥、烟草等植物的SERK同源基因都具有很高的同源性。实时定量PCR结果表明,在平邑甜茶和杂种后代不同组织、花器官中SERK1基因的表达量存在差异,其中在子房中的表达量最高,在营养生长的组织中表达量很低,在平邑甜茶花蕾期的子房中表达量最高。[结论]推测该基因在平邑甜茶和杂种后代的生殖发育过程中可能发挥重要作用。     

金花茶异戊烯焦磷酸异构酶基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为深入研究金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理,在成功提取金花茶花瓣总RNA的基础上,利用同源克隆和RACE技术克隆得到了异戊烯焦磷酸异构酶基因的cDNA序列全长,命名为CnIPI。碱基序列分析表明:CnIPI基因全长916 bp,包含有一个长度为747 bp编码248个氨基酸的开发阅读框。生物信息学分析表明:该基因编码的CnIPI蛋白质分子量为27.97 kD,为稳定亲水性蛋白,无信号肽;CnIPI蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,β-折叠所占比例最少;CnIPI蛋白含有一个典型的异戊烯焦磷酸异构酶结构域。氨基酸序列同源性分析结果表明:CnIPI蛋白与茶、月季、杜鹃等植物IPI蛋白的同源性高于86%。CnIPI基因的克隆使全面理解金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子途径取得了新的突破,为进一步深入研究CnIPI基因的功能及金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理奠定了良好的理论基础。