盐胁迫下转复合多基因欧美杨107杨幼苗生长及生理响应

【目的】通过观测转复合多基因欧美杨107杨(转基因107杨)幼苗在不同浓度盐胁迫下生长性状,质膜透性、光合作用等各项指标,以及外源基因表达产物积累量的变化,综合评价转复合多基因杨树在盐胁迫下的适应能力。【方法】以转化成功且已经过验证的转基因107杨为试验材料,未转基因107杨为对照(CK),进行组培扩繁,在幼苗株高10 cm时定植在花盆中,置于人工气候室中培养。分别用0、3、6 g·L~(-1)的Na Cl溶液进行盐胁迫处理,胁迫25天后观测2个株系幼苗的生长指标、生理参数变化,以及甜菜碱与Bt毒蛋白的积累量。【结果】2个株系的生长指标观测结果表明:在低盐浓度处理下,转基因107杨幼苗株高增长量显著高于非转基因对照,转基因株系幼苗地径增长量与对照差异不显著;高盐浓度处理下,2个株系幼苗株高与地径均受到盐胁迫的显著影响。2个株系的生理参数观测结果表明:在低盐浓度处理下,转基因107杨幼苗质膜透性显著低于对照107杨,叶绿素含量有一定程度的增加,净光合速率与蒸腾速率显著高于对照,光系统Ⅱ实际光合效率Y(Ⅱ)小幅度降低但显著高于对照,光系统Ⅱ能够保持较高的电子传递速率;F_v/F_m增幅较高,具有较大光合作用潜力。在高盐浓度下,转基因株系幼苗叶绿素含量降幅较小,而质膜透性、净光合速率均显著降低,F_v/F_m、Y(Ⅱ)均呈现较大幅度下降,光系统Ⅱ电子传递速率受到较大影响,光合能力下降,变化趋势与对照相同,2个株系幼苗均受到较大程度的盐害。转基因株系中外源基因表达产物积累量的ELISA研究结果表明,随盐浓度的增加,Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜碱含量都呈现增加趋势;在高盐浓度胁迫下外源基因产物积累量均显著增加。【结论】转基因107杨在低浓度盐胁迫下表现出良好的适应性,耐盐性优于对照107杨。在高浓度盐胁迫下转基因株系与对照107杨均受到较大影响,转基因株系并未显示其优势。盐胁迫可以诱导外源Bt基因、BADH基因表达加强,盐胁迫下转基因107杨表现出良好的耐盐和抗虫潜力。     

转不同抗虫基因741杨的抗虫选择性

以转抗虫基因(BtCry3A)741杨7个株系和转双抗虫基因(BtCrylAc API)741杨2个株系为材料,从分子生物学检测、毒蛋白的表达、抗虫性检测3个方面,研究转不同Bt基因741杨对不同类型害虫的抗虫选择性.结果表明:2种Bt抗虫基因分别在转基因741杨不同株系中稳定存在.转BtCrylAc的2个株系毒蛋白含量分别为0.012 7%和0.009 9%,具高抗虫性的株系pb29的毒蛋白含量高于中等抗虫性的株系pb17.转BtCry3A基因的5个株系毒蛋白含量为0.067 8%～0.152 1%,不同株系间存在一定差异.BtCry3型的毒蛋白表达量非常高,是BtCry1型的10倍.用对鳞翅目害虫具高抗虫性和中等抗虫性的转双抗虫基因(BtCrylAc API)741杨株系叶片饲养鞘翅目害虫柳蓝叶甲,幼虫死亡率达到28.4%～42.8%,转基因株系与未转基因的对照没有明显差异.用转BtCry3A基因741杨不同株系叶片饲养柳兰叶甲幼虫,均表现出高抗虫性,死亡率在2天之内均可达到100%;而饲养杨扇舟蛾幼虫,死亡率为0～42.86%,未表现出明显抗虫性,与未转基因对照没有明显差异.     

8年生嫁接转基因杨树Bt毒蛋白的表达与运输

【目的】研究经历多年生长和对复杂自然环境适应后,嫁接的8年生转基因741杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索成年树木Bt毒蛋白的运输部位、运输量、运输的方向性和积累等规律。【方法】利用转Bt Cry1Ac基因741杨与未转基因741杨互为砧木和接穗进行嫁接,在自然条件下生长8年后,对2种不同嫁接方式杨树砧木和接穗的Bt Cry1Ac基因进行PCR检测和验证,利用ELISA技术对成年嫁接杨树的不同部位、不同组织进行毒蛋白含量检测。【结果】Bt Cry1Ac基因的PCR检测结果表明,Pb29/741嫁接杨中接穗部分和741/Pb29嫁接杨中砧木部分均扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,其余非转基因部分和阴性对照未扩增出特异性条带,证明Bt基因在嫁接杨树的转基因部分稳定存在,未发现外源基因丢失现象。ELISA检测表明,2种不同嫁接方式处理的741杨砧木和接穗的叶片、韧皮部、木质部和髓中均检测到Bt毒蛋白存在,证明Bt基因在8年生转基因嫁接741杨中稳定表达,且Bt毒蛋白可以在成年嫁接741杨的砧木和接穗间运输。Pb29/741成年株中,根部为非转基因部分,地上枝干部分为转基因组织,地上转基因组织能够表达Bt毒蛋白,其含量呈现出树冠外侧向内侧逐渐升高,树干部分向下又逐渐降低的趋势,且可以向根和树干基部非转基因组织运输和积累,以韧皮部运输为主。741/Pb29成年株中,根部为转基因部分,地上枝干为非转基因组织,根和树干基部组织也可以表达Bt毒蛋白,且可以由根部和干基部由枝干向树冠外侧运输并积累,以韧皮部运输为主;非转基因枝干部分呈现出树干向上逐渐降低,树冠内侧向外侧逐渐升高的趋势。【结论】尽管嫁接方式不同,嫁接的转基因杨树经历8年生长和复杂自然环境的影响和适应后,Bt毒蛋白的运输都呈现出由转基因组织向非转基因组织运输现象,毒蛋白含量呈现出类似由源向库运输和积累的趋势。转基因杨树可以通过传统嫁接方式在生产上应用,以提高转基因林木的生态安全性。     

741杨双Bt基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性

以含有Cry3Aa基因的重组质粒pBCC3为基础,利用PCR和DNA重组技术,从pBCC3中克隆出抗虫基因Cry3Aa,将其正向插入载体pCAMBIA1305的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建成pCAMBIA1305-Cry3Aa植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的遗传转化法,将Cry3Aa基因转入已转Cry1Ac+API基因的741毛白杨无性系pB29中,获得转双Bt基因的741杨。在含潮霉素的培养基中进行多次继代筛选,获得抗性稳定的无性系9个,编号为pCCA1—pCCA9。采用特异引物分别对转基因植株进行PCR检测,结果显示Cry1Ac基因稳定存在于pB29中,Cry3Aa基因已整合到各无性系的基因组DNA中。ELISA毒蛋白检测,转基因株系都有Cry1Ac和Cry3Aa杀虫蛋白表达。用转基因植株叶片进行柳蓝叶甲(鞘翅目)和美国白蛾(鳞翅目)室内饲虫试验结果表明,转基因植株具有双抗性。根据对测试昆虫的致死率划分高中低3个抗性水平,其中pCCA2,pCCA5,pCCA6,pCCA9具有双高抗;pCCA3,pCCA4和pCCA7对柳蓝叶甲表现出中、低抗性,对美国白蛾则高抗;而pCCA1表现对美国白蛾的极低抗性,对柳蓝叶甲则高抗。     

双抗虫基因对三倍体毛白杨的转化和抗虫性表达

建立三倍体毛白杨叶片再生体系,用部分改造BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂(API)基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法转化三倍体毛白杨无性系,在含卡那霉素50 mg·L-1的分化培养基上诱导产生不定芽的叶片占18%,在生根培养基上对转基因植株做进一步筛选,获得50个转化再生株系.PCR检测表明:80%的植株呈现阳性反应,部分株系进行Southern Blot检测,证明外源基因已经插入杨树基因组中.用Bt毒蛋白抗血清进行ELSA检测,结果表明:7个转基因株系都有Bt杀虫蛋白表达,表达量最高的株系约占叶总可溶性蛋白的0.016 1%.用经分子生物学检测的28个转基因株系叶片进行舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫饲虫试验,结果表明:不同株系幼虫杀死率明显不同,有39.3%的株系对舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫的致死率在80%以上;25.0%的株系对两种害虫的幼虫死亡率均在60%～80%之间;另有35.7%的株系幼虫死亡率在50%以下,有些株系基本未表现出抗虫性.同时具高抗虫性的转基因株系能够明显抑制存活幼虫的生长和发育.     

转Bt基因南林895杨对美国白蛾抗虫性研究

【目的】通过对转Bt基因南林895杨进行虫试测定，分析转基因植物对不同世代美国白蛾Hyphantria cunea的杀虫活性、转基因杨树抗虫效果的时空动态、转基因杨树对不同龄期美国白蛾的杀虫效果，以及对美国白蛾幼虫生长发育的影响，为转基因杨树的应用推广和美国白蛾防治提供相关依据。【方法】以实验室获得的转Bt(Cry1Ah1）基因南林895杨16个株系为材料，对美国白蛾幼虫进行室内喂养和田间套笼饲虫实验，实验分别采用不同世代、不同虫龄的美国白蛾幼虫为实验对象，测量其死亡率、化蛹率及取食量等指标，分析转Bt基因杨树对于美国白蛾生长的实际影响，并选取不同部位叶片分析杀虫效果的空间变化。【结果】16个转Bt基因南林895杨株系中，A-4-6、A-5-0、A-5-23和X-2-7株系具有良好的杀虫效果，幼虫取食叶片12 d后的校正死亡率为37.5%～68.9%。A-4-6株系的毒蛋白表达量最高达到11 500.01 ng/g，占总蛋白表达量的0.047 8%。其余5个杀虫活性较好株系的毒蛋白表达量均大于4 669.38 ng/g，除Z-1-3株系，各株系毒蛋白量占总蛋白量均超过0.02%。抗虫效果明显的株系上部叶片的抗虫效果优于中部叶片，下部叶片的抗虫效果差。不同虫龄比对结果表明低龄幼虫的校正死亡率显著高于高龄幼虫（P 0.05），而化蛹率随着龄期的升高而升高，幼虫对杀虫性的敏感度随着龄期的升高逐渐下降。【结论】转基因南林895杨中Bt基因的表达能够有效的抑制美国白蛾的生长，并具有时空特异性，其中A-4-6、A-5-0及A-5-23三个株系具有良好的杀虫效果，适用于作为抗虫杨树树种进行推广。     

转Btcry3A抗虫基因杨树中毒蛋白的时空表达

转Btcry3A基因741杨(Populus×aldatomentosa cl.741)目前已进人中间试验林阶段,近几年来一些学者对转Btcry3A基因741杨不同株系的抗虫性进行了一系列的室内和野外测定,研究了转Bt基因741杨对目标害虫产卵、生长发育及致死率的影响(甄志先等,2007;王彦平等,2008;王永芳等,2002).测定结果表明转基因741杨不同株系对目标害虫表现出一定抗性.笔者的前期研究结果表明PCC1株系(原CC84株系)对桑天牛(Apriona germari)表现出了较强的抗性(牛小云等,2011),因此对此株系作进一步研究.据报道CaMV35S启动子控制下的基因在不同植物或同一植物不同发育阶段的器官中表达强度有较大的差异(Pauk et al.,1995;Narváez-Vásquez et al.,1992;Williamson et al., 1989;Mazier et al.,1997),并且对转基因棉花(Gossypium)、玉米(Zea mays)等不同器官毒蛋白表达量的测定结果也得到了同样的结论(张俊等,2002;陈旭升等,2006;朱路青等,2005;陈松等,2000;姜志磊等,2008).对启动子CoYMVP控制下的转基因杨树是否也存在同样的现象,目前还未见报道.本研究将对转基因741杨PCC1株系毒蛋白的时空动态表达量进行检测,为PCC1株系的推广利用提供理论依据.     

BtCry1Ac、BADH双价基因对烟草的遗传转化及表达检测

利用农杆菌介导法,将植物转化载体p209-BtCry1Ac-BADH转化烟草,获得了Kan筛选的完整再生植株。经PCR检测证明,4个株系中检测到BtCry1Ac和BADH基因。荧光定量PCR检测表明,检测到目的基因的株系中有3个株系的2个目的基因均在转录水平得到表达,且存在表达差异;有1个株系未检测到BADH基因的表达。ELISA毒蛋白检测表明,经荧光定量PCR筛选的3个株系均检测到毒蛋白的表达,含量最高为414.63ng/g。室内饲虫试验表明,3个转基因株系中只有2个株系对斜纹夜蛾幼虫表现出抗虫性,校正死亡率最高为38.2%,其余均未表现出明显抗虫性。选取2个株系进行组培苗耐盐试验,表明在不同NaCl浓度下,转基因株系与对照之间没有明显差异。研究中,有些系号经PCR检测说明BtCry1Ac和BADH基因已整合到植物基因组中,但荧光定量PCR和ELISA检测表明虽然基因整合到植物基因组中却未表达,有可能发生了基因沉默。     

转基因杨树中外源Bt基因mRNA及其蛋白运输

以741杨和转BtcrylAc基因741杨抗虫株系Pb29互为接穗和砧木进行嫁接,利用RT-PCR和ELSA技术对Bt基因的mRNA及其蛋白是否在砧木与接穗间运输进行研究.RT-PCR检测结果表明:以741杨为接穗或砧木的嫩枝和嫩叶中均未检测到Bt基因的mRNA,说明m基因的mRNA没有在砧木与接穗间进行运输.ELISA检测发现,各嫁接处理的741杨砧木和接穗的叶片、韧皮部、木质部和髓中均检测出Bt毒蛋白的存在,证明Bt毒蛋白可以通过嫁接的方式在砧木和接穗间进行运输.用各嫁接处理接穗叶片在室内喂饲杨扇舟蛾幼虫,发现嫁接转基因杨树的非转基因杨可提高对杨扇舟蛾幼虫的致死率,延长发育历期,表现出一定的抗虫性.     

转多基因1年生库安托杨对溃疡病的抗性分析

[目的]本研究对转多基因库安托杨株系的溃疡病抗病性检测及抗病相关基因的表达分析,为通过基因工程手段培育抗病林木新树种提供有价值的参考。[方法]以转JERF36等多个外源基因的1年生库安托杨株系D5-9、D5-20、D5-21及非转基因受体D5-0为材料,对主干人工接种溃疡病菌的各株系病情指数进行了测定,同时对接种5 d后树皮组织中5个抗病基因的表达情况进行了实时定量PCR(qPCR)分析。[结果]在溃疡病菌胁迫下,3个转基因株系对溃疡病菌的抗性显著优于非转基因受体株系,转基因株系间抗病性也具有一定差异,D5-21的病情指数显著低于其它2个转基因株系;肉桂醇脱氢酶基因在3个转基因株系树皮中表达量均高于对照,类甜蛋白基因仅在D5-19树皮中的表达量高于对照,其他3个基因在转基因株系中的表达量或与对照相当或低于对照。[结论]转多基因库安托杨株系的溃疡病抗性与非转基因对照相比均有显著提高,且转基因株系间差异显著;同时转基因株系中不同抗病基因的表达模式也有很大差异,说明溃疡病菌胁迫下转多基因库安托杨抗病调控的复杂性,其分子调控机制还有待深入研究。     

Bt杀虫蛋白在分月扇舟蛾体内的分布

分月扇舟蛾幼虫取食转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽基因小黑杨后,Bt杀虫蛋白在其中肠、血淋巴、马氏管中含量比较高;而先饲喂转蜘蛛杀虫肽与Bt毒蛋白C肽基因小黑杨4d,再饲喂非转基因小黑杨后,其所繁育的蛹、成虫、卵、幼虫中均不合有Bt杀虫蛋白。     

Analysis on Insecticidal Activity of Bt Transgenic Populus deltoides × P.euramericana cv‘ Nanlin895’ and Its Effects on Soil Microorganism

以转Bt基因南林895杨株系B1、B4、B17、B21扦插苗为试验材料,分析其在室内和野外自然条件下对靶标害虫杨小舟蛾幼虫的抗虫性.结果表明:转Bt基因杨树4个株系均有一定的杀虫活性,其中株系B21对杨小舟蛾1龄幼虫12d校正死亡率高达95.3％；虫试表明转Bt基因杨树各株系扦植苗在野外自然条件下的12 d幼虫校正死亡率8月份为35.0％～88.8％,9月份为40.5％～95.3％.用转Bt基因杨树叶片饲养杨小舟蛾,对照植株杨小舟蛾幼虫化蛹率为83.3％～96.0％,而转Bt基因株系幼虫化蛹率为8.0％～76.7％,二者有显著差异.转Bt基因杨树对杨小舟蛾幼虫的生长发育有抑制作用,饲喂8d后害虫取食量、体质量增长速率显著低于对照.此外,为了解转Bt基因杨树对土壤微生物的影响,对转Bt基因杨树株系及对照进行了根际土壤微生物可培养类群的分析,初步结果显示:转Bt基因杨树根际土壤微生物中细菌、真菌、放线菌的数量与对照比较无显著差异.     

转Bt基因南林895杨抗虫性及对土壤微生物影响分析

以转Bt基因南林895杨株系B1、B4、B17、B21扦插苗为试验材料,分析其在室内和野外自然条件下对靶标害虫杨小舟蛾幼虫的抗虫性。结果表明:转Bt基因杨树4个株系均有一定的杀虫活性,其中株系B21对杨小舟蛾1龄幼虫12 d校正死亡率高达95.3%;虫试表明转Bt基因杨树各株系扦植苗在野外自然条件下的12 d幼虫校正死亡率8月份为35.0%88.8%,9月份为40.5%95.3%。用转Bt基因杨树叶片饲养杨小舟蛾,对照植株杨小舟蛾幼虫化蛹率为83.3%96.0%,而转Bt基因株系幼虫化蛹率为8.0%76.7%,二者有显著差异。转Bt基因杨树对杨小舟蛾幼虫的生长发育有抑制作用,饲喂8 d后害虫取食量、体质量增长速率显著低于对照。此外,为了解转Bt基因杨树对土壤微生物的影响,对转Bt基因杨树株系及对照进行了根际土壤微生物可培养类群的分析,初步结果显示:转Bt基因杨树根际土壤微生物中细菌、真菌、放线菌的数量与对照比较无显著差异。     

毛果杨Rubisco活化酶基因的克隆与功能分析

【目的】核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是参与植物光合作用的第1步碳同化的关键酶,而Rubisco活化酶(RCA)能够使Rubisco处于稳定的催化活性状态,从而提高光合效率。本研究从毛果杨中克隆RCA基因并通过遗传转化南林895杨,获得PtRCA高表达的转基因株系,并进行分子检测及相关功能分析,为培育杨树新型高光效抗逆品种提供依据。【方法】基于毛果杨基因组数据库信息克隆PtRCA基因序列,利用生物信息学对PtRCA基因进行功能和结构分析。采用Gateway技术将PtRCA构建到植物表达载体pGWB406中,以南林895杨为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化。以转PtRCA基因南林895杨和对照(南林895杨)为材料,测定分析在高温胁迫下转基因植株的基因表达、光合参数和叶绿素荧光参数的差异。【结果】从毛果杨中克隆获得PtRCA的CDS序列长1 323 bp,编码440个氨基酸残基,其蛋白相对分子质量为48 315.9 Da,等电点pI为5.57,为疏水性蛋白,无信号肽以及跨膜结构;通过序列对比,发现PtRCA属AAA+超级家族一员,且与大豆、拟南芥RCA蛋白同源性较高。转PtRCA基因南林895杨RCA表达量均高于对照,且能够利用强光充分进行光合作用,其光饱和点也均高于对照,增加约12.5%~37.5%;光补偿点除3号株系外,其他转基因株系均略低于对照;转基因植株在光饱和点的光合速率比对照增高24.6%~55.7%。转基因株系对CO_2的利用能力和羧化效率均强于对照组,CO_2饱和点除1号和4号株系外,其他株系均比对照低12.5%~25.0%;CO_2补偿点比对照降低53.1%~80.4%;光呼吸比对照低37.7%~79.3%,并且转基因杨树在CO_2饱和点的光合速率比对照增高4.4%~26.4%。另外,转基因杨树表现出耐光氧化的能力,光氧化处理后,对照PSⅡ原初光化学效率下降61.7%,而转基因杨树下降45.0%~53.1%;对照PSⅡ实际光化学效率下降54.1%,而转基因杨树下降38.7%~52.0%;光化学猝灭系数对照下降68.3%,而转基因杨树下降51.0%~65.8%;非光化学猝灭系数对照仅增加3.0%,而转基因杨树增加6.0%~26.5%。【结论】杨树Rubisco活化酶(PtRCA)蛋白与大豆、拟南芥RCA蛋白同源性较高。通过实时定量及相关生理分析表明,转PtRCA基因南林895杨具耐高温特性,利用CO_2和强光进行光合作用的能力较强,催化Ru BP进行羧化反应的效率较高。转PtRCA基因杨树能够充分利用吸收的光子,PSⅡ反应中心效率较高,过剩光能量得到较好的耗散,表现出耐光氧化的能力。研究结果表明,PtRCA基因的高效表达提高了转基因植株的光合效率,并对高温高光强具有调节能力。     

超表达牛奶子EutPDS提高番茄果实番茄红素含量

【目的】牛奶子果实中富含番茄红素,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是番茄红素生物合成上游的重要酶。特异性超表达牛奶子Eut PDS基因(Gen Bank登录号:GQ254067),以期提高番茄果实中的番茄红素含量。【方法】通过RT-PCR方法从牛奶子果实中分离EutPDS基因cDNA及基因组全长,Southern杂交分析基因的拷贝数,专用软件分析此基因及蛋白结构。采用番茄2A11启动子构建果实特异性超表达载体,转化根瘤农杆菌GV3101后,借助农杆菌介导的叶盘法转化至‘中蔬四号’番茄。半定量RT-PCR检测转基因植株果实EutPDS基因的表达,高效液相色谱仪、实时定量PCR分别用于分析转基因番茄果实主要类胡萝卜素组分含量和内源类胡萝卜素代谢相关基因表达的变化。【结果】从牛奶子中克隆的EutPDS基因长度为1 920 bp,含有1 749 bp ORF。其基因组序列无内含子,单拷贝。EutPDS编码1个582个氨基酸的蛋白,该蛋白与其他植物PDS有很高的同源性,具有典型的二核苷酸结合域、类胡萝卜素结合域。采用农杆菌介导方法转化番茄叶盘,PCR检测,潮霉素筛选,成功获得了2个EutPDS转基因番茄株系,其果实颜色较对照更红。半定量分析显示外源EutPDS基因在转基因番茄果实中超表达,实时定量PCR分析表明番茄红素生物合成上游2个内源基因Sl PSY和Sl ZDS受影响显著上调,同时1个下游基因Sl LCY-e的表达则显著下调,使得转基因番茄果实中番茄红素含量为野生型的2倍,但β-胡萝卜素含量无显著变化。【结论】在番茄果实中特异性超表达牛奶子EutPDS基因可有效促进番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

橡胶树HbMYB20基因的克隆及其对拟南芥次生壁发育的调控

【目的】MYB转录因子是调控植物木质素合成和次生壁形成的重要转录因子之一。本文分离克隆到一个与拟南芥AtMYB20高度同源的橡胶树MYB转录因子基因HbMYB20,并在拟南芥中对其功能进行研究,以期了解其在橡胶树木质素合成和次生壁发育的分子调控中的作用,为橡胶树木材形成的分子调控机制研究及其遗传改良奠定基础。【方法】采用 blast分析从树皮转录组中筛选出与拟南芥 AtMYB20序列同一性较高的橡胶树 MYB 基因HbMYB20;设计 ORF区特异性引物,以树皮 cDNA 为模板进行扩增得到该目的基因 cDNA 序列。实时荧光定量PCR检测该基因在橡胶树叶片、胶乳、茎干以及木质部与韧皮部的相对表达量。构建 HbMYB20过表达植物载体,使用农杆菌蘸花法转化拟南芥,获得该基因过表达转基因株系。采用乙酰溴法和间苯三酚染色法,分析转基因、野生型拟南芥茎的木质素含量以及木质素在拟南芥茎基部横截面中的分布。对转基因、野生型拟南芥茎基部横截面切片进行甲苯胺蓝染色,并测量分析导管、木质纤维和维管束间纤维细胞的细胞壁厚度。最后,采用实时荧光定量PCR分析转基因及野生型拟南芥木质素和纤维素合成相关酶基因的表达。【结果】克隆得到1个橡胶树 MYB 转录因子基因 HbMYB20,该基因开放阅读框( ORF)为927 bp,编码309aa 的蛋白,氨基酸序列分析显示,HbMYB20与AtMYB20/43和 AtMYB85/42同源性较高,属 R2R3MYB转录因子 G8亚组成员。表达分析显示 HbMYB20在橡胶树茎干和木质部中高表达,胶乳中表达最低。对 HbMYB20过表达拟南芥分析显示,该基因在3个转基因株系中均表达;相对野生型拟南芥,转 HbMYB20拟南芥植株生长抑制,木质部和维管束间纤维的木质素染色面积较少、染色程度变浅,茎的木质素含量和木质纤维、导管及维管束间纤维的细胞壁厚度均显著低于野生型;同时转基因株系中木质素合成关键酶基因4CL1和 CCoAOMT的表达量以及纤维素合成关键酶基因 CesA8的表达显著下调。【结论】橡胶树 MYB转录因子 G8亚组成员 HbMYB20,在茎和木质细胞中高表达。拟南芥中过表达 HbMYB20导致转基因植株的矮小,细胞壁变薄,阻碍木质部中木质素的合成和积累,同时木质素和纤维素合成相关酶基因的表达显著下降。由此推测 HbMYB20对拟南芥的木质素和纤维素合成都具有负调控作用,可能是1个橡胶树次生壁发育的负调控因子。     

欧洲黑杨转基因稳定性及对土壤微生物的影响

利用PCR分析技术 ,分析了田间试验已达 7a的转Bt基因欧洲黑杨的基因稳定性 ,并对其林地和非转基因林地的土壤微生物进行了类群数量分析。PCR分析表明Bt基因仍然存在于转基因植株中 ,转基因植株与对照杂交后代Bt基因分离呈 1∶1比例 ,符合孟德尔遗传分离规律 ,表明基因仍稳定存在。计数结果表明转基因林地中转基因植株与非转基因植株间根系土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,转基因林地与非转基因林地 (邻近杨树林地和健杨林地 )间的土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,说明转基因欧洲黑杨对土壤微生物系统尚没有明显的影响。     

延缓害虫对Bt毒蛋白耐受性的育种策略

在分析害虫对转 Bt毒蛋白基因植株产生耐受性的特点、发生机制的基础上 ,重点探讨了为延缓害虫对 Bt毒蛋白耐受性的育种策略 :(1)培育双价或多价 Bt毒蛋白抗虫品种 ;(2 )寻找能使 Bt毒蛋白基因在植物中高效表达的启动子 ;(3 )使用组织特异型或诱导型启动子以减轻对害虫持续的选择压 ;(4 )将 Bt毒蛋白基因转入叶绿体基因组以解决原核与真核细胞对遗传密码子偏爱的不同 ;(5 )通过突变等技术改变 Bt毒蛋白一级结构 ,从分子水平延缓害虫产生耐受性     

转AmGS基因红叶石楠的分子检测及抗寒性分析

对转AmGS基因(从沙冬青中克隆的肌醇半乳糖苷合成酶基因)的红叶石楠植株进行多项分子检测(PCR,Southern,RT-PCR),结果表明AmGS基因已经整合到转基因株系R6和R7的基因组DNA中,并检测到转录水平上的表达。随后,经对R6和R7两个转基因株系进行连续6代芽切扩繁继代株系的PCR检测,发现导入的AmGS基因传递到所有芽切扩繁后代植株中。植株抗寒能力试验结果表明,在相同低温处理条件下,转基因株系均比未转基因植株的存活率要高。相对电导率测定结果表明,随着处理温度的降低,2个转基因株系相对电导率升高的程度明显低于未转基因的对照植株。低温半致死温度(LT50)测定结果表明,2个转基因株系(R6和R7)的LT50明显低于未转基因的对照植株。上述结果说明导入的AmGS基因提高了转基因株系的抗寒性。     

成龄转基因银中杨试验林外源基因水平转移及土壤微生物连年监测

【目的】对成龄转JERF36基因银中杨——抗逆1号杨试验林进行连年生物安全性监测，评价抗逆1号杨可能引起的生态风险，为评估转基因杨树及转基因植物土壤环境安全性提供依据。【方法】以11年生抗逆1号杨、非转基因银中杨对照、林下杂草、林下土壤、试验林旁行道树下杨树实生苗叶片、土壤中筛选出的卡那霉素抗性菌株为材料，采用PCR扩增方法检测外源基因JERF36稳定性及水平转移潜在性，利用稀释平板法对9～11年生抗逆1号杨与非转基因杨对照林地的可培养微生物(细菌、真菌和放线菌)的种群数量进行分析。【结果】外源基因JERF36在抗逆1号杨中稳定存在，林下杂草、林下土壤、试验林旁行道树下杨树实生苗叶片、土壤中筛选出的卡那霉素抗性菌株的DNA样品中均未出现目的基因片段。9～11年生抗逆1号杨与非转基因对照间林下土壤中微生物总数量均无显著差异；不同年份间的抗逆1号杨和非转基因对照的林下土壤微生物数量均略有差异且趋势一致，其中6—8月土壤中微生物总量为9年生>10年生>11年生；9～11年生抗逆1号杨和非转基因对照林地土壤3大类微生物(细菌、真菌和放线菌)数量均无显著差异，各年变化趋势一致，在树木...