转AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

目的DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记，在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中，通过化学诱导表达实验，研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性，为建立杨树甲基化诱导变异体系，进而实现杨树品种改良等奠定良好基础。方法以白杨派优良品种84K杨无菌苗叶片为受体材料，采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtDME1基因导入‘84K’杨；经过潮霉素筛选、常规PCR检测及DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理，处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h，采用qRT-PCR检测处理叶片中外源基因AtDME1的表达量变化。结果本研究中，潮霉素分化筛选共获得了抗性芽224个，经生根筛选获得6株抗性植株，经分子检测证实这6株抗性植株均为转AtDME1基因植株，扩繁后分别标号为转基因AD-1 ~ 6。qRT-PCR检测结果显示，化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时，目的基因AtDME1的表达量基本达到最大值，效果持续至12 h后逐渐减弱。结论化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtDME1基因的表达，为进一步研究DME1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础，也为杨树化学诱导表达特性的研究做好了铺垫。      

转多基因1年生库安托杨对溃疡病的抗性分析

[目的]本研究对转多基因库安托杨株系的溃疡病抗病性检测及抗病相关基因的表达分析,为通过基因工程手段培育抗病林木新树种提供有价值的参考。[方法]以转JERF36等多个外源基因的1年生库安托杨株系D5-9、D5-20、D5-21及非转基因受体D5-0为材料,对主干人工接种溃疡病菌的各株系病情指数进行了测定,同时对接种5 d后树皮组织中5个抗病基因的表达情况进行了实时定量PCR(qPCR)分析。[结果]在溃疡病菌胁迫下,3个转基因株系对溃疡病菌的抗性显著优于非转基因受体株系,转基因株系间抗病性也具有一定差异,D5-21的病情指数显著低于其它2个转基因株系;肉桂醇脱氢酶基因在3个转基因株系树皮中表达量均高于对照,类甜蛋白基因仅在D5-19树皮中的表达量高于对照,其他3个基因在转基因株系中的表达量或与对照相当或低于对照。[结论]转多基因库安托杨株系的溃疡病抗性与非转基因对照相比均有显著提高,且转基因株系间差异显著;同时转基因株系中不同抗病基因的表达模式也有很大差异,说明溃疡病菌胁迫下转多基因库安托杨抗病调控的复杂性,其分子调控机制还有待深入研究。     

AtMET1基因在84K杨中的遗传转化及诱导表达分析

[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtMET1基因导入84K杨基因组中;经潮霉素筛选获得抗性植株,通过常规PCR检测、DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外源基因AtMET1表达量变化。[结果]本研究共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得18株抗性植株,经分子检测证实全部为转基因植株,分别标号为AM-1～18#。qRT-PCR结果显示:化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtMET1的表达量即达到最大值,随后在处理6 h时表达量下降,处理12 h时有所回升,处理24 h后表达量降低至不足12 h时的一半。[结论]化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1基因的表达,为进一步研究MET1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为今后杨树化学诱导表达研究及品种改良提供新思路、新方法。     

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析

  目的  干旱、高盐等逆境胁迫严重影响了植物的生长发育。研究表明,组氨酸激酶在植物逆境响应中起重要作用。本研究对银腺杨‘84K’组氨酸激酶基因PaHK3a在不同组织的表达模式分析,检测了其对生长素、细胞分裂素等植物激素处理下及人工干旱、盐碱等非生物胁迫下的表达,结合干旱、盐碱条件下丙二醛（MDA）及保护酶活性等生化指标,对该基因的功能进行了初步鉴定,为杨树抗逆分子育种研究奠定基础。  方法  以‘84K’杨无菌苗为材料,通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析PaHK3a基因在不同组织的表达模式。对‘84K’杨无菌苗进行浓度为10 mmol/L植物激素处理（ABA、6-BA、IBA、GA3及水杨酸（SA））及非生物胁迫处理（42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG6000）,采用qRT-PCR技术分析PaHK3a基因对不同植物激素及非生物胁迫的表达响应;进一步对温室‘84K’杨进行自然干旱处理（6、8、10 d）、200 mmol/L NaCl（2、4、6 d）处理,测定不同胁迫时间点叶片PaHK3a基因的表达,以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及MDA含量,并分析PaHK3a基因表达与生理指标的相关性,初步鉴定杨树PaHK3a基因的功能。  结果  qRT-PCR结果显示,PaHK3a基因在叶片中表达量最高,根部中等,茎段最低。与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG模拟干旱处理时,PaHK3a基因表达量与对照相比明显增高,分别为对照的2.63、1.49、1.54、1.58倍。用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈现显著下调。在温室干旱、盐碱胁迫处理过程中,PaHK3a基因表达均显著高于对照,呈现先上升后下降的表达模式,MDA含量也呈现类似的趋势,而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高,POD活性在干旱胁迫时先上升后下降,而高盐胁迫时呈上升趋势。生理指标与PaHK3a基因表达量相关系分析发现,在干旱和盐胁迫下,PaHK3a基因表达量与叶片MDA含量、SOD活性和POD活性均呈正相关。  结论  PaHK3a基因在‘84K’杨根茎叶中均有表达,且叶中表达量最高;PaHK3a基因表达受细胞分裂素6-BA、GA3及ABA及SA等植物激素的负调控,同时,受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控;温室人工干旱盐碱胁迫过程中,PaHK3a基因表达量升高,且与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性均具有正相关性。研究结果初步显示,杨树PaHK3a基因参与杨树植物激素激素信号响应,并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。