花生小叶外植体植株再生及农杆菌介导的基因遗传转化

鄂花四号、中花四号和豫花一号萌动４ｄ的小叶作外植体，通过器官再生在ＭＳ培养基加３ｍｇ／ＬＢＡＰ和１ｍｇ／ＬＮＡＡ上诱导芽分化，转至ＭＳ加５ｍｇ／ＬＢＡＰ上诱导芽伸长，再生植株。芽诱导率为８６％～１００％，每个外植体平均再生５个植株。在培养基中加入１ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３和５００ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素能有效抑制愈伤褐化和死亡，并能提高植株再生率。萌动４ｄ的小叶与农杆菌ＡＧＬ１分别共培养２ｄ，通过在再生培养基中加卡那霉素筛选，获得转基因再生植株，转基因植株生根后，移栽网室生长，并已开花结荚。外源基因的表达通过卡那霉素抗性和Ｇｕｓ活性组织化学检测得到证实。     

农杆菌介导法将β—1,3—葡聚糖酶基因导入油菜的研究初报

将克阼的烟草β－１,３－葡聚糖酶基因插入双子叶植物高效表达载体ｐＢｉｎ４３８中,构建了植物表达载体ｐＢＬＧ。利用农杆菌介导法,将此抗真菌基因导入甘蓝型双低油菜品种Ｈ１６５中,得到了抗卡那霉素的再生植株,并探讨了影响油菜分化的几个要素。结果表明：乙酰丁香酮及硝酸银等物质对油菜分化及绿苗的形成具有重要作用; 采对卡那霉素十分敏感,提高卡那霉素浓度可可能将一部分转化体淘汰,对８株再生株株进行了ＰＣＲ检测     

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

Ti质粒介导的B、t、k-δ内毒素蛋白基因转化大豆的初步研究

以Ｔｉ质粒为介导，将ｐＫＴ５４Ｂ７Ｃ５质粒上的Ｂ、ｔ、ｋ－δ内毒素蛋白基因导入东北大豆“黑农３７”、“黑农３９”等品种。采用多种外植体和感染方法，从胚轴和子叶节诱导出丛生芽与再生植株。经卡那霉素筛选和冠瘿碱检测，初步证明外源基因导入大豆基因组中。共获得８１株再生植株，其中成活３０株，仅３株结７个荚，得到７粒种子。ＰＣＲ检测和ＤＮＡ分子杂交，鉴定这７株再生植株呈阳性反应，证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。７粒种子均已萌发，植株生长发育正常     

双价抗菌肽基因转化辣椒

在建立高效快速辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）子叶离体培养和植株再生体系的基础上,将昆虫抗菌肽Ｂ、Ｄ基因构建而成的双价质粒ｐＣＤＢ－Ⅱ以逐杆菌为介导转入５个辣椒栽培品种,共获得Ｋａｎ＾Ｒ植株１２００多株,对部分Ｋａｎ＾Ｒ植株进行点杂交、ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测,结果证明了外源基因被成功整合。盆栽接青枯菌试验,结果显示,转基因植株具有较强的抗病力。     

几丁质酶基因转化甜菜的初步研究

本试验通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导法将菜豆几丁质酶基因导入甜菜（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ,Ｌ．）,再生植株经卡那霉素筛选后,进行ＰＣＲ分析,结果表明：再生植株的转化率为２７．３％,甜菜叶柄是转化的较好受体。     

甜叶菊组织培养条件的研究：I.外植体,激素浓度,琼脂浓度对愈伤组织形成及？

以茎尖为外植体进行甜叶菊的组织培养，比以叶柄，叶片，茎段，下胚轴为外植体，愈伤组织诱导率，出芽率都高；在ＭＳ基本培养基上，适合茎尖生长，分化的激素浓度为０．５ｍｇ／Ｌ，ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ；琼脂浓度为０．７％。     

甜叶菊组织培养条件的研究Ⅰ．外植体、激素浓度、琼脂浓度对愈伤组织形成及芽诱导的影响

以茎尖为外植体进行甜叶菊的组织培养，比以叶柄、叶片、茎段、下胚轴为外植体，愈仿组织诱导率、出芽率都高；在ＭＳ基本培养基上，适合茎尖生长、分化的激素浓度为０．５ｍｇ／ＬＢＡ、０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ；琼脂浓度为０．７％     

茶种质资源室内保存技术研究──茶树茎切段试管苗保存技术

应用组织培养技术保存茶树种质资源，是当今人们正在探索的一种有效、安全的新途径。茶树茎切段试管苗保存技术的研究结果表明，诱导茎切段培养基以ＭＳ或改良ＥＲ基本培养基附加ＢＡ０．０４ｍｇ／Ｌ－４．００ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０４ｍｇ／Ｌ－０．５０ｍｇ／Ｌ为宜。茎切段的芽诱导率在品种间或同一品种不同季节间存在着明显的差异。茎外植体采样以春梢为好。弱光照、较低温和适当添加化学抑制剂（如甘露醇、ＰＰ＿３３３、ＡＢＡ等）有利于延缓培养物生长、增加培养物保存期。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因转化葡萄的研究

以根癌农杆菌介导的叶盘法转化技术将huIGF－Ⅰ基因转入葡萄组织细胞，并通过既成的再生－转化体系诱导筛选huIGF－Ⅰ转基因葡萄植株，在抗性筛选中使用卡那霉素浓度为（Kan.)40mg/L，使用的根癌农杆菌工程菌株为EHA105／pBIGF－Ⅰ、EHA105／pCIGF－Ⅰ。最后用PCR技术、Southern blot对转基因植株作分子鉴定，其检测阳性率分别为60％和66.6%。     

PVYCP基因导入加工型马铃薯甘农薯1号的研究

利用整合有马铃薯Y病毒外壳蛋白基 (PVYCP基因 )的改建质粒PEY3,以土壤农杆菌为载体转化加工型马铃薯新品种甘农薯 1号叶盘 ,细菌侵染 14d后用 10 0ml/LKM在愈伤组织水平上选择 ,转化率最高可达 2 1 3%。转化效率与细菌生理状态、NAA浓度、叶盘预培养天数有关。转化体分化 2株再生植株。冠瘿碱分析证明转化体整合了PVYCP基因。     

通过农杆菌介导把Harpin_(Ea)基因导入马铃薯的初步研究

应用农杆菌介导的叶盘法进行马铃薯遗传转化研究。通过D3、D4培养基筛选法 ,把HarpinEa蛋白基因导入马铃薯四倍体栽培种大西洋 (Atlantic) ,获得 10 7个转化株系。并经过卡那霉素的抗性鉴定和PCR分子检测 ,有 5 9株PCR检测呈阳性 ,占所有转化植株的 5 5 14%。结果表明HarpinEa基因已整合到马铃薯的基因组中。转化植株的抗病性鉴定正在进行中。     

农杆菌介导法将抗草甘膦基因转入玉米自交系

利用农杆菌介导法将抗草甘膦基因(ssu-G₂-aroA)转入优良玉米自交系R18-599和齐319,侵染后的愈伤组织转至潮霉素浓度为10 mg/L的筛选培养基上,继代筛选3轮,每轮3周;得到的抗性愈伤组织在含有潮霉素浓度为3 mg/L的分化培养基上进行分化,R18-599获得30株再生植株,齐319获得18株再生植株。经PCR鉴定后共得到7株转化抗性植株(4株R18-599、3株齐319)。经PCR-Southern及RT-PCR检测结果表明,ssu-G₂-aroA基因已稳定整合到了玉米基因组中,并在RNA水平上得到表达。     

通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶基因导入马铃薯

选用两个生产上主栽马铃薯品种“鲁引 1号”和“鲁引 4号”的试管微型薯为材料 ,通过农杆菌介导成功地将菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯中。试管微型薯薯片与农杆菌共培养 3d后 ,转到含卡那霉素 10 0mg/L的分化培养基上诱导不定芽分化。待抗性芽长到 1 0～ 1 5cm高时 ,转入含卡那霉素 10 0mg/L的液体培养基中进行生根筛选。经过分化和生根两轮筛选的转化植株的PCR检测结果均为阳性 ,而未经转化的对照植株为阴性 ,证明该筛选系统是可靠的。早熟品种鲁引 1号的转化频率明显高于晚熟品种克新 4号 ,其最高转化频率为 4 1 0 % ,平均每个外植体可得到 3 85株转化苗。转化植株的抗病性鉴定正在进行中     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

 研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25 μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA（+）/nptⅡ（-）/Cre（-）的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%~46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3 d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率（144.44%）也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。     

农杆菌介导的DnMADS2基因转化金钗石斛初步研究

为建立稳定有效的金钗石斛转化体系,进一步研究花发育相关基因的功能,为石斛兰分子育种提供基础,本研究以金钗石斛类原球茎（PLBs）为转化受体,通过农杆菌介导的方法将DnMADS2基因转入金钗石斛。结果表明：用20 mg/L潮霉素筛选4个月后获得抗性PLBs,对其进行HPT基因和DnMADS2基因的PCR检测表明,目的基因已成功整合到PLBs中。获得的转化PLBs在抗性培养基上分化为不定芽后,再经生根壮苗培养获得转化植株。对转化植株进行Southern检测,结果表明,DnMADS2基因已整合到5株金钗石斛转化植株基因组中。据此建立的稳定高效的金钗石斛转化体系和获得的转基因植株,将为DnMADS2基因功能的进一步研究和金钗石斛转基因育种奠定基础。     

基因枪对大豆进行PSY基因的转化研究

以3个大豆品种的体细胞胚为受体,以PSY为目的基因,应用基因枪法对大豆进行了遗传转化,实验结果表明:不同大豆基因型的体细胞胚对抗性选择标记(Hyg)的敏感性存在极显著差异;高渗处理的培养基加入0.4mol/L甘露醇有利于PSY基因的导入;对已获得10株抗性再生苗,经PCR和PCR-Southern分析鉴定,有4株为阳性,初步证明外源基因PSY已整合到大豆的基因组中.     

花粉管通道法转化荔枝的初步研究

为开拓荔枝转基因育种新途径,以GUS基因作为报告基因,用花粉管通道法转化授粉后24 h的‘新球蜜荔’荔枝雌花,并统计座果率、成苗率、转化率。结果显示：共获得303株实生苗,经PCR检测和GUS染色法证实外源基因整合到4株荔枝苗基因组中,转化率为1.32%。此研究结果为荔枝生物技术育种提供了一种简单有效的途径。